Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
бактериальный рост и не оказывают заметного влияния на жизнеспособность
многих эксплантатов, например:
рифампицин (50 мкг/мл) в сочетании с тетрациклином (10 мкг/мл),
карбенициллин (500 мкг/мл), ванкомицин (100 мкг/мл). ж> МSO может не
подойти для роста культур корончатых галлов или косматого корня некоторых
видов, и соответственно могут потребоваться другие среды, содержащие
низкие концентрации гормонов или более сложные добавки. Особенно важно
использовать такие среды на ранних стадиях после индукции опухоли, если
экспериментатор пытается регенерировать побеги из неонкогенных клеток,
содержащихся в ткани, поскольку обычно нх рост не стимулируется средами,
свободными от экзогенных фитогормонов.
3> На эксплантатах многих видов косматые корни или корончатые галлы
могут установиться гораздо быстрее, если их перенести на среды,
содержащие бактериостатические антибиотики, пока они еще прикреплены к
кусочкам первоначального эксплантата стебля, черешка или листа.
2.3. Трансформация больших гетерогенных эксплантатов с помощью
неонкогенных Ti-плазмидных векторов
Приступить к эксперименту по трансформации с помощью неонкогенных
векторных систем следует после выбора подходящих эксплантатов и условий
инокуляции и селекции, позволяющих получать резистентные к антибиотику
каллусы с помощью онкогенных штаммов агробактерий и угг-помощников
(описанных в разд. 2.2). Необязательно, что условия, дающие эффективную
трансформацию определенного эксплантата с помощью онкогенной векторной
системы, подойдут для трансформации с помощью неонкогенных векторов.
Неонкогенные ткани гораздо чувствительнее к условиям культивирования,
поскольку в них, очевидно, не проявляются физиологические и ростовые
свойства ткани корончатых галлов и косматого корня. И в этом случае
подходящие комбинации zu'r-систем, хозяйских штаммов агробактерий и
селективных генов можно установить только эмпирически.
Большие гетерогенные эксплантаты - это срезы органов, содержащие
огромное количество клеток. Например, такие эксплантаты, как листовые
диски или сегменты стебля, клубня, корня, черешка и проростка, часто
содержат различные типы
118
Глава 2
тканей и клеток, способных- при культивировании in vitro де-
дифференцироваться н переходить к пролиферации. После обработки подобных
эксплантатов агробактериями для регенерации трансформированных растений
можно использовать три основных способа.
1. Трансформированные побеги можно регенерировать непосредственно из
каллуса, развивающегося на эксплантатах в селективных условиях, используя
среду для индукции побегов, содержащую антибиотики.
2. Побеги можно регенерировать непосредственно из эксплантатов на ср"де
для регенерации и провести скрининг на экспрессию маркеров трансформации.
Кроме того, трансформированные побеги можно определить по нормальной
способности к корнеобразованию на селективной среде.
3. Трансформированные побеги можно регенерировать через стадию каллуса. В
этом случае с помощью культивирования на соответствующей селективной
среде на эксплантатах получают каллусы. Затем из установившихся
трансформированных тканей (каллусных или суспензионных культур)
индуцируют индивидуальные побеги путем эмбрио- или органогенеза на среде
для регенерации. Стратегия включает, во-пер-вых, регенерацию в
присутствии селектирующего агента и, во-вторых, без селектирующего агента
с последующим укоренением в его присутствии или скринингом на экспрессию
маркерного гена.
Итак, побеги можно регенерировать либо непосредственно из
эксплантатов, либо через стадию каллуса, а селекцию проводить или
одновременно с регенерацией, или после нее.
При использовании агробактернй в качестве трансформирующих векторов
существенно, чтобы достаточное число интакт-ных клеток в участках
поранения тканей эксплантатов переходила к дедифференцировке и клеточному
делению. Следует сохранить на минимальном уровне прямой органогенез
адвентивных органов и продолжающийся рост из предсуществующих меристем,
поскольку нет уверенности, что клетки, вступившие на этот путь развития,
могут быть трансформированы. Если не контролировать последние два пути
развития, то придется применять лабораторные методы скрининга для
идентификации трансформированных побегов на фоне гораздо большей
популяции побегов, полученных из нетрансформированных тканей.
В качестве примера ниже описывается получение подходящих эксплантатов
из тепличных растений табака (листовых дисков) и из культивируемых in
vitro проростков льна (гипокоти-лей). Подробности, касающиеся других
видов растений, см. в приложении 2[VIII].
Трансформация клеток двудольных растений
119
Разработка системы неонкогенной трансформации для больших гетерогенных
эксплантатов сводится к следующим этапам:
1. Определяют подходящую среду, которая стимулирует регенерацию побегов
из участков поранения (желательно у ряда эксплантатов).
Примечание: Важно убедиться, что зачатки побегов не развиваются из
