Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
гипокотиля) и картофеля (модифицированных столонов - корневых побегов).
- Ночные культуры агробактерий (разд. 1.3):
A. Неонкогенный штамм A. tumefaciens (например, С58С1 (PGV3850) [84]).
Б. Онкогенный штамм A. tumefaciens, содержащий доминантный селективный
маркерный ген (например, pTiB6S3 :: pMON 200 содержит nos-npt-II-гш,
способный, как известно, к эффективной экспрессии в растительных клетках
[30]).
B. Штамм A. rhizogenes дикого типа (например, А4 [77]).
Г. Штамм A. rhizogenes дикого типа, несущий неонкогенный бинарный вектор
(например, A4(pBinl9). [35]).
Растворы
[Ростовые среды (приложение 2[Н]) и антибиотики [приложение 2[Ш]).]
:-Чашки Петри диаметром 9 см, содержащие 25 мл агаризо-ванной среды для
поддержания жизнеспособности эксплантатов во время совместного
культивирования с агробактериями (например, MSO и RD) и для удаления
бактерий после трансформации (например, MSO+Cx [250 мкг/мл] и RD+ +Сх
[250 мкг/мл]).
- 100 мл жидкой ростовой среды для разведений инокулята Agrobacterium
(например, среды MSO).
2.2.3. Методика
Индукция опухоли На больших эксплантатах, когда участки поранения
удалены от ростовой среды
Данные методы подразумевают использование стерильных проростков, целых
органов растения или срезов запасающих тканей, культивируемых на -средах,
не содержащих бактерио-статических агентов.
1. Готовят стерильные эксплантаты, как описано в приложении 2 [IV].
2. Стерильным скальпелем срезают верхушки у размножаемых in vitro
растений3' или у развивающихся стерильных проростков либо используют
недавно начавший формироваться стебель, целый лист, целый черешок или
эксплантаты запасающих органов.
112
Глава 2
3. Инокулируют поверхности разреза с помощью микробиологической петли
ночной культурой6* агробактерий, как изображено на рис. 2.6. Кроме того,
можно повредить ткань растения иглой для подкожных инъекций (номер 25)
или зубочисткой, которые предварительно погрузили в ночную культуру
агробактерийЕ|.
4. Инкубируют инокулированный растительный материал в течение 2-6 нед при
25 °С и низкой освещенности (2000- 4000 люкс) и периодически наблюдают за
ростом корончатого галла г) или косматого корня.
Индукция опухоли на небольших эксплантатах в условиях контакта участков
поранения с питательной средой
Для воспроизведения данного метода используют эксплантаты (гипокотили,
семядоли) стерильных развивающихся проростков (приложение 2[IVA]),
фрагменты проростков более позднего возраста (стебель, черешок, корни и
листья) и срезанные ткани (например, листья, черешки и чашелистики) от
более зрелых тепличных растений (приложение 2[1УБ]). Срезы тканей
инкубируют в жидкой питательной среде, содержащей небольшое количество
агробактерий в течение такого промежутка времени, чтобы успела пройти
трансформация, а затем переносят на твердую среду, содержащую
бактериостатические агенты для инактивации агробактерий.
1. Готовят фрагменты ткани из стерильных проростков или более зрелых
растений (приложение 2 [ IV]).
2. Готовят 20 мл разведенной в 50 раз ночной культуры агро-бактерий в
жидкой ростовой среде (например, в MSO) и,выливают в чашку Петри
диаметром 9 см.
3. Помещают 15-100 срезанных кусочков ткани (в зависимости от размера) в
суспензию агробактерий и инкубируют в течение 2-5 чд) в стерильном
ламинарном боксе.
4. Переносят эксплантаты на твердую питательную среду, например MSO (30-
100 эксплантатов на чашку), и инкубируют (25 °С) при низкой освещенности
(2000-4000 люкс) в течение 2-6 дней либо до тех пор, пока не начнут
появляться бактериальные колонии.
5. Переносят эксплантаты на твердую питательную среду, содержащую
бактериостатические антибиотики (например, MSO+Cx [250 мкг/мл])е)>ж), и
инкубируют, как указано и а стадии 4, в течение 3-6 нед, постоянно
наблюдая за их состоянием.
Оценка индукции опухоли
В некоторых случаях опухоли, индуцированные при различных комбинациях
эксплантата и штамма агробактерии, можно
Трансформация клеток двудольных растений
113
различить уже через одну неделю и наблюдать за их развитием с помощью
обычной лупы. Важно оценить, какие слои клеток в эксплантатах каждого
типа чувствительны к трансформации, и сделать тщательные наблюдения,
которые помогут в будущем выработать оптимальную стратегию
трансформации^. Таким образом, в отношении всех типов эксплантатов
изучаемых растений следует поставить следующие вопросы.
1. Каков результат трансформации различных эксплантатов неонкогенным
штаммом A. tumefaciens, например С58С1 (pGV3850)? В частности, какие слои
тканей/клеток в эксплантате еще способны к ограниченному клеточному
делению и образованию каллуса после инфицирования агробактериями на
данной среде?
2. Действительно ли эксплантаты различных органов одних и тех же видов
отвечают на индукцию опухоли онкогенными штаммами агробактерий различным
образом? Каково, например, влияние эксплантата на частоту индукции
опухолей, на время, которое проходит до появления неопластического роста,
