Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
клетки, которые как компетентны для трансформации, так и способны
регенерировать в целые растения. Эксплантаты могут варьировать по
сложности от изолированных протопластов до целых проростков или
фрагментов зрелых органов (рис. 2.6). Исходя из предположения, что
поверхность по крайней мере некоторых клеток эксплантатов двудольных
растений доступна для контакта с агробактериями и эти клетки способны
делиться in vitro, при разработке системы трансформации нового растения
прежде всего надо рассмотреть возможность воспроизводимой регенерации
данных растений. Многое зависит от эмпирического опыта подбора подходящей
среды для регенерации побегов. Однако нельзя не учитывать основную
анатомию, физиологию и характер развития выбранного растения при
идентификации подходящих эксплантатов для культуры ткани, которые на
какой-то стадии перейдут к регенерации побегов. Без этих фундаментальных
знаний поведение эксплантатов будет непредсказуемым и, следовательно,
обострит любые проблемы, связанные с идентификацией, возможно, редких
трансформированных тканей. Например, общие внешние условия роста
донорного растения, размер эксплантата и онтогенез выбранного в качестве
источника органа часто определяют последующее поведение в культуре ткани.
В больших гетерогенных эксплантатах, например сегментах листа, обычно
только клетки определенных областей в ответ на воздействие ростовой среды
переходят к делению и/или формированию зачатка органа. Часто на обширных
участках эксплантата наблюдается слабый ростовой ответ, а вместо этого
происходит разрушение хлорофилла, почернение (обычно вызываемое
продукцией полифенольных соединений) или разбуха-
ВЕКТОР Рост трансформированных Типы тканей на среде MSO
клеток
A Ti> плазмида
Отсутствует рост
опухолей на трансформированных тканях
Б Ri-плазмида
для образования каллуса и/или регенерации побегов
ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ РАСТЕНИЯ
Случайные oiikoi сннм" карликовые побеги, которые не Оудуг укоренлгьсн
На некоторых опухолях, индуцированных нопалиновыми штаммами, образуются
побеги из неонкогенных клеток благодаря продукции цитокинина
агробактериями
Случайная регенерация Ктг-побегов, которые обычно утрачивают
фертильность и не укореняются
Случайная регенерация Kmr -побегов из клеток,содержащих Т-ДНК бинарного
вектора, но не содержащих онкогенную Т-ДНК
Ктг-побеги нормальной морфологии, образовавшиеся из трансформированных
клеток
Регенерация из трансформированных
Ri-плазмидой культур косматого корня у многих видов. Растения обычно
имеют складчатые листья и плагиотропный корень, но часто фертильны
Случайная регенерация растений с нормаль* ной морфологией из
нетрансформированных корней, которые обнаруживаютсн в опухоли косматого
корня
Все растения обладают Ri -фенотипом, н*
Ri- и Ктглокусы a Fn иногда ' сег |>*'1 ируюг; и результате образуются
трансформированные растения, утратившие онкогенные свойства
Из трансформированных клеток, содержащих Т-ДНК бинарного вектора, но
утративших онкогенную Т-ДНК Ri -плазмиды, случайно регенерируют Ктг-
побеги с нормальной морфологией
Рнс. 2.5. Стратегии трансформации растений бинарными векторами совместно
с оикогеиными и неонкогенными
Ti- и Ri-плазмидами в качестве шУ-
помощников.
Трансформация клеток двудольных растений
105
ние клеток, что сильно увеличивает размер эксплантата. Эти три основных
типа ответа часто оказывают ингибирующее действие на трансформацию.
Однако важно осознавать, что присутствие исходного материала донорного
растения, вероятно в результате эндогенных уровней гормонов или особого
типа физиологии эксплантата, часто оказывает драматическое воздействие на
клетки, начавшие интенсивно делиться в ответ на культивирование.
Например, у многих видов с высокой частотой удается индуцировать зачаток
органа непосредственно из свежих эксплантатов тканей или каллуса, все еще
находящегося в контакте с исходным эксплантатом, тогда как устоявшийся
каллус, изолированный от таких эксплантатов, может потерять способность к
регенерации побегов даже после одного пассажа.
Регенерация обычно с трудом происходит из трансформированных
недифференцированных тканей, полученных из культивируемых более
нескольких месяцев клеток суспензии, а еще с большим трудом из каллусов,
полученных из протопластов [3, 28]. Таким образом, прежде чем
осуществлять трансформацию любой разновидности растений, чрезвычайно
важно определить наиболее чувствительный эксплантат. Для многих
культурных видов главной трудностью остается трансформация клеток,
способных регенерировать побеги ("органогенез") или способных к
эмбриогенезу, и поэтому большинство методов разработано в результате
экспериментов на модельных системах культуры тканей, таких, как табак и
петуния. Для ясности большинство из рассматриваемых ниже методик основано
на использовании именно таких модельных систем. В целом все основные
