Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
неспецифичной продукции целлюлозы многие бактерии и растительные клетки
упаковываются в сетку фибрилл, что приводит к образованию больших
совместных агрегатов растительных клеток и бактерий. Бесцеллюлозные
92
Глава 2
мутанты агробактерий связываются с поверхностью растительных клеток
значительно слабее [51], и, следовательно, роль-целлюлозы скорее всего
сводится к закреплению агробактерий1 на поверхности поврежденных
растительных клеток перед переносом Т-ДНК.
2.1.2. Поведение культивируемых растительных клеток, влияющее на их
трансформацию агробактериями
Поскольку цель большинства экспериментов по генетической трансформации
заключается в получении целых, фертильных трансформированных растений,
имеет смысл в общих чертах изложить основные особенности культивирования
растительных тканей, которые влияют на выполнение поставленной задачи.
2.1.2.1. Возможное поведение растительных клеток в культуре
Многие типы растительных клеток, например клетки зародыша на
относительно ранних стадиях его развития и покоящиеся (неделящиеся)
клетки паренхимы, меристем и сосудистых тканей камбия (рис. 2.3),
находятся в состоянии, называемом недетерминированным. Другими словами,
они способны различным образом дифференцироваться в зависимости от
внешнего воздействия. Два простых примера - это ответ растения на
повреждение, в процессе которого недетерминированные клетки, окружающие
область раны, дифференцируются и" претерпевая быстрое клеточное деление,
формируют дедиффе-ренцированный каллус с адвентивными (придаточными)
корням ми. Появление придаточных корней обычно наблюдается приг
размножении растений черенкованием. Напротив, клетки, перешагнувшие в
своем развитии рубеж, на котором они уже определились как будущие клетки
специализированного типа, например лигнифицированные сосудистые элементы
ксилемы, ткани флоэмы и одревесневшие корковые клетки, не способны к
передифференцировке и достигли так называемого детерминированного
состояния.
Рисунок 2.4 иллюстрирует три основных типа роста эксплантатов в
культуре.
А. Переход к дедифференциации недетерминированных клеток эксплантата и
рост в виде каллуса. Сюда можно отнести " образование клеточных колоний и
каллуса из протопласто" или изолированных растительных клеток. Такие
недифференцированные ткани могут стабилизироваться в жидких суспензионных
культурах и расти неопределенно долго. Иэ недифференцированных тканей
многих видов можно регене-
Трансформация клеток двудомных растений
93
А Меристематические зены у растаиий
Кончик побега
Б Пластическое развитие у растений
Раневой ответ
Клетки
на поверхности раны погибают
Клетки следующего слоя становятся меристематическими и делятся, формируя
каллус
Развитие органов
Рис. 2.3, Нормальные меристематические зовы и пластическое развитие у
растений.
94
Глава 2
А Недифференцированные
В Развитие уже существующих органов
а) Верхушка побега б) Зародыши
6) Пазушные почки
Ь Развитие адвентивных органов
а) Корни
Рис. 2.4. Основные типы роста эксплантатов растений в культуре.
Трансформация клеток двудольных растений
95
рировать целые растения либо путем органогенеза (индукции побегов),
либо путем эмбриогенеза.
Б. Продолжающийся рост из предсуществующих меристем, включая а)
непрерывный рост органов, таких, как корни и побеги, в виде полностью
дифференцированных структур, содержащих детерминированные клетки, б)
продолжающееся нормальное развитие незрелых структур, таких, как эмбрионы
на ранней стадии, и в) развитие покоящихся побочных примордиальных почек
в побеги.
В. Инициация и развитие примордиев дополнительных органов непосредственно
из клеток эксплантата без промежуточной стадии каллуса.
2.1.2.2. Компетентность растительных клеток для трансформации векторами
на основе агробактерий
Индукция корончатого галла и косматого корня агробактериями обычно
происходит в участках поранения, и растительные клетки, как полагают,
компетентны для трансформации только в течение короткого промежутка
времени, вероятно, соответствующего S-фазе клеточного цикла, когда
происходит репликация генома [52]. Поранение может привести к следующим
последствиям: 1) обеспечить бактериям доступ к участкам узнавания на
поверхности клеток, 2) стимулировать связанное с раневым ответом деление
клеток, обеспечивающее компетентность растительных клеток для
трансформации, и 3) стимулировать продукцию образующихся в ране
соединений, например ацетосирингона, которые привлекают агробактерии и
активируют шг-гены, необходимые для переноса Т-ДНК. Таким образом, для
достижения трансформации клетки растения должны находиться в S-фазе и
быть легкодоступны для вирулентных агробактерий (рис. 2.3). Особенно
важно отметить, что зачатки многих органов' в сложных эксплантатах,
таких, как сегменты гипокотилей и стебля, часто развиваются из покоящихся
меристем или специфичных тканей, глубоко запрятанных под несколько слоев
