Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 52

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 184 >> Следующая

на локализацию, размер опухоли и морфологию?
3. Существует ли зависимость между зонами нормального образования
каллуса и локализацией опухолей, индуцируемых на различных эксплантатах?
В качестве примера на рис. 2.7 приведены типичные результаты
инокуляции ряда эксплантатов запасающих органов различными штаммами
агробактерий. На эксплантате моркови, инокулированном неонкогенным
штаммом С58С1 (pGV3850), можно ясно видеть, что в ограниченной области
происходит образование каллуса (рис. 2.7,А). Элементарные знания анатомии
главного корня моркови позволяют предположить, что клетки, отвечающие на
поранение дедифференциацией и делением, локализуются в сосудистых тканях
или вблизи от них. Частота образования каллуса будет различной у разных
видов. Наблюдения на эксплантате моркови, инокулированном онко-генным
штаммом Agrobacterium tumefaciens (рис. 2.7, Б), показывают, что
образование опухолей происходит в тех же участках, что и нормальное
каллусообразование. На срезах свеклы после инокуляции A. tumefaciens
узкие зоны опухолевого роста тоже формируются вблизи сосудистых тканей
(рис. 2.7,В). Пожалуй, наиболее очевидные данные о месторасположении
компетентных клеток могут быть получены при выявлении локализации
участков усиленного роста косматых корней, индуцированных штаммов A.
rhizogenes А4 (рис. 2.7, Г). Каждый корешок образовался в результате
отдельного события трансформации и может быть легко идентифицирован,
поскольку имеет тенденцию "вырастать" из эксплантата, и поэтому корешки
нельзя спутать с индуцированным поранением каллусом. Таким
114
Глава 2
образом, на клубнях картофеля, который состоит в основном из запасающей
ткани паренхимы, в ответ на раневое поражение области деления клеток
распределяются случайным образом так же, как и косматые корни (рис. 2.7,
Г). В то же время на моркови косматые корни образуются главным образом из
сосудистых тканей (рис. 2.7, Д, Е).
Культивирование опухоли и селекция трансформированных
клеток
Располагая изложенными выше сведениями, можно воспроизвести
эксперименты, используя онкогенные штаммы агробактерий, содержащие
векторы с доминантными селективными маркерными генами, и подбирая
соответствующие условия (например, концентрацию антибиотиков и временной
режим после-инокуляции до применения селекции). Это обеспечит селекцию
резистентных к антибиотику трансформированных клеток на средах, не
содержащих добавок фитогормоновЧ
Впоследствии в случае успеха аналогичные процедуры можно использовать
для трансформации растительных клеток не-онкогенными векторами, несущими
доминантные маркерные гены, и для получения резистентных к антибиотику
каллусов или побегов на средах, содержащих соответствующие концентрации
фитогормонов и селективного агента.
В другом случае может оказаться более целесообразным перенести
бинарные векторы с помощью конъюгации в штамм агрсбактерий, проявляющий
повышенную вирулентность в отношении интересующих исследователя
эксплантатов, а затем попытаться регенерировать резистентные к
антибиотику побеги из трансформированных, неонкогенных клеток,
присутствующих в опухолевой ткани.
1. Удаляют опухоли из больших эксплантатов диаметром 3-10 мм или косматые
корни при длине 0,5-1,5 см и помещают на 5 мл соответствующей
агаризованной среды, содержащей бактериостатический агент [например, MS +
Cx (500 мкг/мл) ]е>' ж>'3), в пластиковую чашку Петри диаметром 5 см.
Кроме того, срезают опухоли, растущие из участков поранения на небольших
эксплантатах, или переносят эксплантаты целиком на ту же самую среду,
содержащую антибиотикие)' ж>. На эТой стадии на каждую чашку удобно
поместить по 5-15 опухолевых новообразований, чтобы обеспечить
достаточную плотность инокулируемых тканей и быстрый рост
трансформированных тканей.
2. Через 3-6 нед (в зависимости от скорости роста опухолевой ткани)
'переносят эксплантаты на MSO, содержащую 250 мкг/мл цефотаксимад)> е\ и
с этого момента сохраняют на этой же среде до тех пор, пока ткани не
"освободятся"
Трансформация клеток двудольных растений
115
от агробактерий. В противном случае, если/цефотаксим не подходите),
используют пониженные концентрации других бактериостатических
антибиотиков. Приготовление стерильных исходных растворов антибиотиков
описано в приложении 2[Ш]. Заметим, что опухоли могут быть перенесены на
среду, содержащую антибиотики, с целью селекции трансформированных
растительных клеток, в которых экспрессируются. доминантные маркерные
гены на любой стадии (например, при трансформации с использованием
pTiB6S3 : : pMC)N200)e). *>• 3>.
3. Можно регенерировать трансформированные растения из косматых корней,
индуцированных у определенных видов (приложение 2[VIII]). Из некоторых
корончатых галлов дикого типа, индуцированных у определенных видов
(тополь и люцерна), тоже удалось регенерировать трансформированные
растения с нормальной морфологией и фертильностью. Таким образом, если в
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed