Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
качестве помощника wtV-функций бактериального хозяина используют штаммы
A. rhizogenes или A. tumefaciens, содержащие Ri- или Ti-плазмиды дикого
типа, то можно разработать средыд>- е)> ж) и условия культивирования,
позволяющие регенерировать из опухолей резистентные к антибиотику
трансформированные побеги. Часть последних может утратить онкогенную Т-
ДНК и представлять собой морфологически и физиологически нормальные
побеги (сведения относительно отдельных видов даиы в приложении 2
[VI11]).
4. Периодически проверяют стерильность корончатых галлов или косматого
корня путем инкубации небольших кусочков в питательном бульоне в течение
2 сут при 25 °С с интенсивной аэрацией на качалке. Если опухоль не
содержит бактерий, то она может расти на среде, свободной от
бактериостатических антибиотиков. Однако всегда благоразумно сохранять
образцы наиболее важных линий трансформированных клеток, используя среды,
содержащие бактериостатические антибиотики.
Разработка конкретной методики трансформации с помощью неонкогенных
векторов
Исходя из описанных выше предварительных опытов с онко-генными
штаммами агробактерий, разработка методики успешной трансформации, как
правило, основывается на'следующих экспериментах:
1. Идентифицируют эксплантаты, которые дают начало дедиф-ференцированным
клеткам, способным к регенерации побочных побегов или эмбриогенезу. Для
этого необходимо рассмотреть следующий круг вопросов: Каков
регенеративный
116
Глава 2
потенциал слоев клеток, компетентных для трансформации? Образуют ли
способные к трансформации ткани каллус, который после срезания и
субкультивирования на среде для регенерации перейдет к органогенезу
побегов или эмбриогенезу? Может быть, можно прямо регенерировать побеги
после ограниченного образования каллуса, пока он еще прикреплен к
исходному эксплантату? И наконец, будет ли эксплантат нормально
продуцировать побеги без промежуточной стадии каллуса непосредственно от
зачатков, индуцированных в более глубоких слоях эксплантата?
2. Для разработки методов получения неопластических, резистентных к
какому-либо антибиотику каллусов на безгормо-нальной среде в качестве
помощников используют онкоген-ные угг-плазмиды с бинарными векторами,
содержащими доминантный ген устойчивости к антибиотикуд). Это позволяет
определить условия, оптимальные для трансформации.
3. Подбирают условия селекции, позволяющие отбирать резистентные к
антибиотику каллусы или регенерированные растения из эксплантатов,
трансформированных неонкоген-ными векторами на содержащей гормоны среде.
Примечания
а> В качестве примера получение размноженных побегов табака описано в
разд. 2.4.3.
в> При выращивании бактериального инокулята (см. разд. 1.3) в некоторых
случаях целесообразно перед инокуляцией осадить бактерии и ресуспен-
дирсвать их в ростовой среде Для растений.
*> При использовании агробактернй, вызывающих образование побеговых
мутантов, как правило, лучше инокулировать эксплантаты, содержащие
неповрежденный апекс, который будет продуцировать ауксины и
способствовать опухолевому росту.
г) Не путайте каллусообразование (часто ассоциированное с сосудистыми
тканями) с неопластическим ростом. Тщательные наблюдения помогут
определить области компетентных клеток в эксплантате для будущей работы с
неонкогеннымп векторами.
д) На этой стадии агробактерии прикрепляются к клеткам, расположенным в
участках поранения. Предложены различные методики, при воспроизведении
которых эксплантаты оставляют в жидкой среде на продолжительное время,
чтобы произошли и прикрепление, и трансформация. Время инкубации в этом
случае может составлять до нескольких дней в зависимости от того, как
инкубация влияет на жизнеспособность эксплантата. Однако многие ткани
быстро разрушаются при инкубации в жидкой среде, особенно в присутствии
высоких концентраций агробактерий. Таким образом, большинство типов
эксплантатов достаточно обмакнуть в среду, содержащую агробактерии, и
трансформация происходит в норме на твердой среде в течение двух дней
перед переносом на среду, содержащую бактериосгатнческие антибиотики.
Среда MSO может не подойти для поддержания эксплантатов в процессе
трансформации некоторых видов растений. Возможно, для сохранения
жизнеспособности, стимулирования клеточного деления и достижения
компетентности к трансформации потребуется добавить в нее ростовые
Трансформация клеток двудольных растений
117
фитогормоны, особенно цитокинины. В частности, при использовании он-
когенных плазмид в качестве шУ-ломощников для неонкогенных бинарных
векторов важно стимулировать деление трансформированных, резистентных к
антибиотику неонкогенных клеток в месте поранения на соответствующей
среде, содержащей фитогормоны.
е) При работе с некоторыми эксплантатами среда MSO+Cx (приложение 21II]
) не подавляет рост агробактерий или ингибирует образование каллуса. В
этом случае можно использовать другие антибиотики, которые ингибируют
