Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
манипуляции с культурой ткани должны быть действенными для успешной
разработки системы трансформации конкретных видов растений. Информация
относительно культивирования тканей многих видов содержится в следующих
литературных источниках [4, 24, 25, 26, 70, 83].
2.2. Трансформация с помощью онкогенных штаммов дикого типа A.
tumefaciens и A. rhizogenes
2.2.1. Основные положения
Индукция корончатых галлов может быть достигнута во всех случаях,
когда Ti-плазмида содержит vir- и опс-reны, а индукция косматого корня -
при использовании штаммов A. rhizogenes дикого типа, содержащих Ri-
плазмиды. Как мы уже упоминали во введении к гл. 1, некоторые штаммы
агробактерий более вирулентны по отношению к эксплантатам одних видов
растений, чем других; это может зависеть от vir-
106
Глава 2
А Большие эксплантаты
например, выращенные в теплице проростки; резмножаемые in vitro растения;
запасающие органы зрелых растений
Косматый
корень
(Ri)
к,
&
[€7
Каллус
(неонкогенный)
р а
ы и
хН
Срезают поврежденный участок и проводят селекцию резистентных к
антибиотику клеток корончатых галлов, косматых корней или каллуса
|г-4УЗь^
<---Ог-о-р
Корончатый галл
Косматые корни
Каллус
функций или областей Ti-плазмиды вне Т-ДНК или от хромо сомного фона
хозяйского штамма агробактерий. Только эмпи рически можно определить,
удачна ли соответствующая комби нация этих факторов для данного типа
эксплантата конкретно го сорта растения.
Трансформация клеток двудольных растений
107
В Небольшие эксплантаты
например, эксплантаты из стерильных проростков,
размножаемых in vitro растений и выращенного в теплице материала
Агробактерии
_JP.
+ Сх
О
о
Совместное культивирование с агробактериями
Бактериостатическая
обработка
Селекция трансформантов
В Культуры клеток/суслензий
Рис. 2.6. Основные способы трансформации растительных клеток векторами
иа основе агробактерий.
Обычно цель состоит в инокуляции участка поранения, который физически
отделен от питательной среды так, что бактерии не контаминируют культуру,
либо в инокуляции эксплантатов на твердой или в жидкой среде небольшим
количеством агробактерий с последующим переносом инокулированных
эксплантатов на среды, содержащие бактериостатические антибиотики (рис.
2.6). Первый подход позволяет проводить трансформацию без включения в
питательную среду антибиотиков, которые могут повлиять на рост
эксплантата, а также сводит к минимуму образование каллуса вокруг раны.
Кроме того, он
Ю8
Глава 2
способствует выживанию агробактерий во время развития опухоли в месте
поранения; в этой ситуации любые гормоны, сек-ретируемые отдельными
штаммами, могут влиять на компетентность растительных клеток и
органогенез.
Для большинства видов наиболее подходящим материалом для индукции
опухоли служат стерильные проростки или размножаемые in vitro растения.
Очень важно использовать стерильный растительный материал, чтобы избежать
контаминации трансформированной растительной ткани посторонними
микроорганизмами. Такие загрязнения, если их не контролировать с помощью
антибиотиков, инфицируют культуральную среду и могут привести к гибели
растительных клеток. Кроме того, они способны исказить результаты любых
биохимических или молекулярных исследований, проводимых на
трансформированном материале. Если семена или размножаемые in vitro
растения недоступны, тогда в отдельных случаях следует инокули-ровать
растения in vivo, а также стерилизовать ткань корончатого галла или
косматого корня и перенести ее в культуру. В других случаях для индукции
опухоли in vitro можно попользовать поверхностно стерилизованные
эксплантаты материала, растущего в теплице, при условии, что стерильность
эксплантатов строго контролируется.
Подходящими эксплантатами считаются целые стерильные проростки,
эксплантаты проростков (например, гипокотили, семядоли, листья и корни),
эксплантаты выращенной в теплице рассады, более зрелые или размножаемые
in vitro растения (например, корень, стебель, лист, черешок, фрагменты
цветковых и запасающих органов). Состав используемых сред в какой-то мере
зависит от вида растения и типа эксплантата. Например, для роста
проростков или эксплантатов побегов может подойти среда, используемая для
поддержания культуры побегов того же вида растения. С другой стороны,
фрагменты запасающих тканей (клубней, главных корней) часто сохраняют
жизнеспособность в течение нескольких недель при культивировании на
агаризованной среде, содержащей только неорганические соли. У большинства
