Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
способности расти на питательной среде, содержащей антибиотики, в норме
токсичные для таких клеток. Из подобных резистентных к антибиотикам
тканей можно регенерировать нормальные побеги с помощью стандартных
методов культуры тканей. Однако при попытках трансформировать
растительные клетки неонкогенными векторными системами на основе Ti- или
Ri-плазмид перед исследователем встает следующая проблема. В отличие от
индукции корончатого галла или косматого корня неонкогенные
трансформированные растительные клетки необходимо снабдить ростовой
средой строго определенного состава, содержащей правильное соотношение
фитогормонов. Такие среды специально подбирают для конкретных видов (или
даже сортов) растений, чтобы поддержать образование каллуса после
непродолжительного деления клеток в ответ на поранение. Обычно пораженную
ткань культивируют in vitro - с этим подходом связаны различные проблемы,
имеющие отношение к селекции трансформированных клеток:
1. Культуральная среда стимулирует рост и нетрансформированных клеток,
которые и так составляют большинство.
2. Для подавления роста агробактерий необходимо использовать антибиотики,
которые могут ослаблять рост и регенеративную способность культивируемых
клеток.
3. Во многих случаях необходимо обеспечить деление редких
трансформированных клеток в месте поранения до того, как начнет
действовать селекция, иначе токсичные продукты, образующиеся при некрозе
соседних нетрансформированных клеток, могут оказаться губительными.
102
Глава 2
2.1.3.4. Использование онкогеиных tur-хелпериых плазмид
Недавно различными группами исследователей была продемонстрирована
высокая частота котрансформации (одновременной трансформации) онкогенной
Т-ДНК из Ti- или Ri-плазми-ды дикого типа и неонкогенной Т-ДНК бинарного
вектора, когда обе плазмиды локализуются в одной и той же клетке
Agrobacterium [5, 35, 72]. Основываясь на этих данных, было показано, что
штаммы A. tumefaciens и А. rhizogenes, несущие бинарные векторы, могут
индуцировать опухоли, в которых обнаруживаются клетки, содержащие Т-ДНК
обоих или одного типа, что позволяло регенерировать из подобных тканей
достаточное число резистентных к антибиотику неонкогенных растений [7,
21, 27, 69]. Данный подход часто обеспечивает высокую частоту
трансформации клеток, в особенности когда в качестве ш'г-помощника
используют супервирулентные штаммы [7, 21]. Выросты из резистентных к
антибиотику опухолей косматого корня часто содержат множество
неонкогенных корней [15]. В таких опухолях растения, регенерирующие из
корневых клонов и содержащие только неонкогенную Т-ДНК, можно отбирать по
их резистентности к соответствующим антибиотикам и по нормальной
морфологии [69, 78]. Использование штаммов A. rhizogenes дикого типа в
качестве ytr-помощников облегчает, таким образом, узнавание
трансформированных тканей.
Регенерация из неонкогенных клеток в большинстве опухолей корончатых
галлов в норме репрессирована действием гормонов, секретируемых
онкогенными клетками. Однако недавно показано, что эффективной индукции
корончатых галлов может способствовать использование в качестве ш'г-
помощников определенных нопалиновых штаммов A. tumefaciens, о которых
известно, что они секретируют транс-зеатин [15]. Локус транс-зеатина
(fes) расположен у границы шг-области, и хотя он не обязателен для
переноса Т-ДНК, транс-зеатин увеличивает частоту индукции опухолей,
воздействуя на растительные клетки [2]. Кроме того, полагают, что
секреция цитокининов агробактериями важна для управления процессом
регенерации из ко-корончатых галлов, индуцированных на некоторых видах
растений [27].
В дополнение к этим наблюдениям показано, что два не-ецепленных
сегмента Т-ДНК, присутствующие в одной и. той же трансформированной
клетке, сегрегируют в Fi-поколений [22, 60]. Таким образом, если даже
большинство морфологически аномальных растений, регенерированных из
культуры косматого корня или опухолей побегового типа, содержат он-
когенную Т-ДНК при условии, что неонкогенная Т-ДНК не присутствует в той
же хромосоме, что и Т-ДНК бинарного вектора,
Трансформация клеток двудольных растений
103
эти локусы сегрегируют в Ft-поколении, что позволяет полу-чить полностью
неонкогенные трансформированные растения.
Таким образом, выработано несколько стратегий трансформации сохранения
жизнеспособности тканей, получаемых кло-нально из трансформированных
клеток, и обеспечения их селекции на основе устойчивости к антибиотикам
(рис. 2.5). Цель подробно описанных в этой главе практических примеров
заключается в знакомстве исследователя с некоторыми из основных методов;
будут изложены основные соображения о том, какие подходы можно
использовать для трансформации того или иного растения.
2.1.4. Основные методы трансформации растительных клеток с помощью
агробактериальных векторов
В пределах конкретных видов для многих приложений генетической
инженерии растений важно идентифицировать культивируемые растительные
