Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
клеток эксплантата (см. гипокотиль льна на рис. 2.11,5). Хотя такие
клетки способны к регенерации в Побеги, их расположение может
препятствовать контакту с агробактериями и, следовательно, трансформации.
2.1.3. Селекция трансформированных тканей и регенерация растений
2-1.3.1. Трансформированные клетки, нндуцнруемые штаммами агробактерий,
несущими Ti- н Ri-плазмиды дикого типа
Вырезание трансформированной ткани из опухолей коронча-тых галлов или
косматого корня - относительно простая операция, поскольку
злокачественные клетки образуют нарост на
96
Глава 2
поверхности эксплантата. Большинство исследований показывает, что
трансформированные клетки корончатых галлов, происходят из одной или
нескольких первоначально трансформированных компетентных клеток в области
раны, ^трансформированные клетки, обнаруживаемые в опухолях корончатых
галлов, поддерживаются, как считают, за счет "перекрестного питания"
фитогормонами от опухолевых клеток [63, 56]. Известно, что индивидуальные
корешки из опухоли косматого корня имеют клональное происхождение [20,
60]. Ауксины, которые секретируются корнями, трансформированными Ri-
плазми-дой, тоже стимулируют развитие корней из неонкогенных клеток,
присутствующих в месте поранения или в эксплантатах опухолей косматого
корня [15]. Число этих клеток зависит от вида растений и типа
эксплантата.
2:13.2. Селективные и скрииируемые маркерные гены
В современных Ti-плазмидных векторных системах, таких, как pBin
19/pAL4404 и pGV3850 : : 1103 (гл. 1), onc-гены замещены на гены
резистентности к антибиотикам и гербицидам (табл. J2.1) в качестве
доминантных селективных маркеров трансформации. Эти и многие другие
аналогичные векторы известны как неонкогенные или "разоруженные". В них
сохранены только повторы длиной 25 п. н. из Т-ДНК и иногда ген опин-
синтазы из Т-ДНК Ti-плазмиды дикого типа; такие векторы не индуцируют
опухолевый рост у эксплантатов. Скрининг трансформированных тканей может
быть очень утомителен, хотя доказано, что в некоторых случаях он полезен.
В настоящее время известно большое разнообразие скринируемых генов
.(табл. 2.\).
Селективные маркерные гены
Примеры векторных систем, содержащих разнообразные селективные
маркерные гены, обсуждались в гл. 1, а используемые в настоящее время
селективные фенотипы представлены в табл. 2.1. Хотя можно предположить,
что маркерные гены эффективно экспрессируются у большинства, если не у
всех видов растений, следует проявлять осторожность в выборе маркерного
гена, поскольку различные виды растений чрезвычайно варьируют по признаку
чувствительности к селективным агентам. Например, устойчивость к
канамицину успешно использовалась в качестве селективного фенотипа при
трансформации различных видов растений (приложение 2[VIII}), но в
отношении других видов растений канамицин иногда неэффективен. Это
обусловлено либо толерантностью к высоким уровням этого соединения, либо
гиперчувствительностью, приводящей к массово-
Трансформация клеток двудольных растений
97
му некрозу растительной ткани на селективных чашках. Дру* гие селективные
маркерные гены, приведенные в табл. 2.1, не нашли широкого применения
либо в результате недостаточной надежности методик проведения селекции
(гены устойчивости к метотрексату и хлорамфениколу), либо потому, что это
более поздние конструкции и, вследствие этого, очень мало известно
относительно возможности их широкого использования, кроме стандартных
систем культуры ткани, таких, как табак и петуния (гены резистентности к
гигромицину, блеомицину и глифо-сату). '
Селективный агент, чтобы быть полезным, должен создавать сильное
селективное давление в отношении рассматриваемой ткани растения.
Эффективность отдельных соединений как селективных агентов способна
меняться в зависимости от типа выбранного эксплантата или селектируемой
ткани. Например, уровень дифференциации, тип и размер эксплантата,
подвергаемого давлению селективной среды (протопласт, клетка, колония
клеток, суспензионный агрегат клеток, клетки суспензии, встзгпившие в
эмбриогенез, быстро растущие изолированные каллусы, регенерирующий
каллус, каллус, прикрепленный к эксилантату, изолированный побег, побег,
прикрепленный к эксплантату или каллусу, корень, эмбрион, проросток), -
все это влияет на применимость любого селективного маркерного гена в
каждом конкретном случае. Нельзя предполагать, что фенотип,
представляющий собой хороший селективный маркер для какой-либо ткани
одного вида растения, будет столь же эффективен для других разновидностей
(и даже для других эксплантатов) того же вида.
Скринируемые маркерные гены
Скринируемые маркерные гены целесообразно использовать в тех случаях,
когда частота трансформации высока, а транс-фор м^раванные ткани в
основном .имеют клональное происхождение; примерами могут служить
трансформированные побеги, корни и колонии, полученные из высеваемых с
низкой плотностью протопластов и, по-видимому, развившиеся из отдельных
