Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
2.1. Введение
С тех пор как в 1962 г. были впервые сконструированы неонкогенные
векторы, системы генетической трансформации, основанные на использовании
агробактерий и компонентов Tift Ri-плазмид, были разработаны для
сравнительно небольшого числа видов растений. Большинство фундаментальных
исследований по контролю экспрессии нормальных, модифицированных или
химерных растительных генов в трансгенных растениях проводилось на
Nicotiana iabacum. Это не случайность; данный факт отражает ту простоту,
с которой можно осуществлять манипуляции в культуре табака для получения
как эффективной генетической трансформации, так и, что более важно,
регенерации трансформированных растений. Хотя у большинства двудольных
растений при заражении некоторыми онкогенными штаммами агробактерий
образуются опухоли, остается проблема селекции тканей, трансформированных
неонкогенной T-ДНК, и еще большая проблема образования трансформированных
побегов из таких тканей. Не следует забывать, что существует множество
других подходов к проблеме переноса генов, особенно для однодольных
растений, которые не основаны яа использовании агробактерий, и эти
подходы обсуждаются в гл. 3.
В настоящей главе мы надеемся дать представление о взаимодействии
между агробактериями и растительными клетками, которое приводит к
успешной трансформации. Предложенные методики различаются главным образом
выбором векторной системы, типом эксплантата, методами селекции
трансформированных тканей и регенерации трансформированных растений. В
этой главе подробно описаны различные подходы к генетической
трансформации растений векторами на основе агробак-терий при
использовании в качестве модельных систем табака, льна и моркови и
рассмотрены главные факторы, которые необходимо учитывать при попытках
адаптировать любую методи-
88
Глава 2
ку для использования на других растениях. В приложении" 2[VIII]
представлена специальная информация относительно' генетической
трансформации других видов растений с помощью" векторных систем на основе
агробактерий.
2.1.1. Основные свойства агробактерий и векторов, которые используются
для трансформации клеток растений
О роли Ti-плазмид в возникновении заболевания "корончатый галл" и
Ri-плазмид в индукции заболевания "косматый корень" мы уже упоминали в
гл. 1. Индукция опухолей корончатых галлов и косматого корня на
эксплантатах проростков и
Рис. 2.1. Опухоли корончатого галла и косматого корня. Эксплантаты
стебля табака инокулировали (А) возбудителем корончатых галлов
Agrobacterium tumefaciens и (?) бактерией, вызывающей заболевание
косматого корня, Agrobacterium rhizogenes.
их стерильное культивирование после удаления агробактерий с помощью
обработки антибиотиками остаются простейшим методом введения генов во
многие двудольные растения. Это обусловлено тем, что на поверхности
зараженного растения образуются опухоли (в случае заражения A. rhizogens
- на корнях) и злокачественные клетки легко распознать (рис. 2.1) и
перевести эксплантаты в культуру in vitro. Опухоли корончатых галлов
большей частью образованы трансформированными клетками, которые способны
расти на питательной среде, не содержащей фитогормонов, и, следовательно,
обогнать в росте любые нетрансформированные клетки, присутствующие в
исходной опухоли. Однако онкогенные клетки корончатых галлов
Трансформация клеток двудольных растений
89
1 яе способны регенерировать в целые трансформированные растения, и,
таким образом, данный метод имеет ограниченное .применение. С другой
стороны, отдельные трансформированные жор ни, эксплантированные из
опухолей косматого корня, имеют клональное происхождение и не содержат
нетрансформиро-ванных клеток [60]. В противоположность корончатым галлам
сообщалось об успешной регенерации побегов из опухолей косматого корня, а
в некоторых случаях такие побеги развивались в зрелые растения [77, 55,
57, 46, 69, 78J. У этих трансформированных растений часто наблюдаются
некоторые морфологические аномалии [77], такие, как. окручивание листьев,
пониженная апикальная доминантность, укороченные листья, измененная
фертильность и потеря положительного геотропизма в большей части корневой
системы. Причина утраты опухолевого фенотипа в настоящее время
окончательно не установлена [77]. Прежде чем обсуждать различные подходы
к трансформации растений с помощью агробактерий, необходимо дать
¦некоторые более детальные представления о взаимодействиях между
агробактериями и клетками растений в процессе нормального образования
опухоли, а затем в общих чертах изложить историю получения систем
трансформации на основе Ti-н Ri-плазмид.
¦2.1.1.1. Онкогены Т-ДНК и регенерация растений из опухолей,
(индуцированных агробактериями
'В течение последних нескольких лет гены Т-ДНК Ti-плазмид подробно
изучались [2, 44]. Известно, что по крайней мере три из них кодируют
ферменты, принимающие участие в конститутивном биосинтезе ауксина (ims 1
