Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 55

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 49 50 51 52 53 54 < 55 > 56 57 58 59 60 61 .. 184 >> Следующая

клеток, находящихся в глубоких слоях первоначального эксплантата,
поскольку они не чувствительны к агробактериям!
2. Определяют наиболее благоприятные внешние условия для роста растения-
донора, чтобы получить наиболее чувствительные эксплантаты.
3. Оценивают оптимальный тип и размер эксплантата, который можно
.использовать при данном объеме среды " в данной культуральной посуде.
4. Определяют концентрации соответствующего антибактериального агента
(например, цефотаксима или карбеницилли-на), которые ингибируют рост
агробактерий, но еще допускают более или менее нормальное образование
каллуса и регенерацию побегов.
5. Определяют минимальные концентрации селектирующих агентов
(антибиотиков, например канамицина, гигромицина и блеомицина, или
гербицидов, например глифосата), которые подавляют: а) образование
каллуса; б) регенерацию побегов и в) укоренение побегов.
6. Подбирают условия инокуляции и инкубации, которые позволяют
эксплантату достаточное время оставаться жизнеспособным при контакте с
агробактериями, чтобы обеспечить возможность трансформации без нарушения
образования каллуса или регенерации побегов.
7. Подбирают оптимальную комбинацию ш'г-помощника, Ti-плазмиды и
собственного генотипа агробактерий.
Результаты этих экспериментов позволяют разработать новые системы
трансформации с использованием лЬбых типов больших гетерогенных
эксплантатов и не ограничиваются только листовыми дисками или срезами
гипокотиля.
2.4. Прямая регенерация трансформированных растений: трансформация
листовых дисков табака
2.4.1. Основные положения
Во многих случаях при культивировании растительной ткани легче
регенерировать побеги из эксплантатов органов, чем из полученных на
основе протопластов тканей или устоявшихся
120
Глава 2
(адаптированных) каллусных культур. Онкогенная область Т-ДНК во многих
широко используемых неонкогенных векторах A. tumefaciens заменена на
доминантный селективный маркерный ген. В настоящем эксперименте маркерный
ген кодирует фермент неомицинфосфотрансферазу-П (NPT-II), однако можно
использовать и другие маркерные гены, и эксплантаты различных видов
растений (приложение 2 [VI11 j). Неоми-цинфосфотрансфераза-II
фосфорилирует и, таким образом, инактивирует антибиотик канамицин,
который в норме токсичен для клеток высших растений. Трансформированные
клетки в месте поранения, экспрессирующие ген NPT-II, можно отбирать на
средах, содержащих канамицин. В другом случае ино-кулированные
эксплантаты можно поместить на среду для регенерации побегов, где Кшг-
побеги развиваются непосредственно из трансформированных клеток с
небольшим дополнительным образованием каллуса. Агробактерии удаляют путем
обработки антибиотиками, которые нетоксичны для растительных клеток,
такими, как цефотаксим (более подробную информацию об антибиотиках см. в
приложении 2[Ш]).
Листовые диски, полученные от размножаемых in vitro или тепличных
растений, особенно удобны для экспериментов по трансформации пасленовых,
например Nicotiana tabacum, Petunia hybrida и томатов (см. [40,49]), а
также некоторых других семейств. При культивировании на соответствующих
средах листовые диски быстро переходят к формированию каллуса в области
срезанных краев эксплантата, особенно там, где они находятся в контакте
со средой. Если такие эксплантаты поместить непосредственно на среду для
регенерации побегов, то в течение короткого промежутка времени (10-15
дней) вблизи срезанных краев появляются побеги вместе с сопутствующим
каллусом. Среды, которые стимулируют регенерацию из листовых дисков,
обычно отличаются высоким отношением цито-кининов к ауксинам.
Описанная в настоящем разделе методика трансформации предусматривает
использование листовых дисков Nicotiana tabacum. Важно отметить, что
срезы листовых пластинок табака не содержат покоящихся почек или
преформированных зачатков органов и, следовательно, большинство побегов,
формирующихся у края среза, происходит из дедифференцированных клеток,
чувствительных к трансформации агробактериями. Многие другие типы
эксплантатов содержат покоящиеся меристемы или почки и могут
преимущественно продуцировать зачатки побегов из меристем камбия или
других глубоких слоев клеток эксплантата, которые нечувствительны к
агробактериям. Такова ситуация с гипокотилями льна, и для подобных
эксплантатов требуется другой подход к регенерации трансформирован-
Трансформация клеток двудольных растений
121
ных побегов (разд. 2.5). Обсуждение методов регенерации растений можно
найти в ряде обзоров [3, 24, 28]. Следует подчеркнуть, что метод листовых
дисков применим не ко всем видам, поскольку его воспроизведение целиком
зависит от способности эффективно регенерировать побеги из
дедифференцированных клеток в месте поранения. Например, доказано, что
довольно трудно адаптировать данный метод для картофеля (хотя он и
относится к пасленовым [67]).
2.4.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
Предыдущая << 1 .. 49 50 51 52 53 54 < 55 > 56 57 58 59 60 61 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed