Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 56

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 184 >> Следующая

- Обычные материалы для культуры тканей- (приложение 2[1]).
- Горшки (Н. Smith Plastics Ltd.), содержащие компост Ле-вингтона
(Fisons Ltd.).
- Маленькие прозрачные пластиковые пакеты.
- Ночные культуры неонкогенных штаммов агробактерий, несущих доминантные
маркерные гены, и контрольных штаммов (приложение ЦП]), разведенные в 50
раз жидкой средой для культивирования растений (например, MSO). Для
примера:
С58С1 (pGV3850)-Ti-плазмида нопалинового типа с деле-тированными олс-
генами.
С58С1 (pGV3850 : : 1103) -pGV3850 со встроенным в Т-ДНК
nos-npt-II геном.
Или:
LBA4404 - штамм шУ-помощник, несущий Ti-плазмиду, у которой Т-ДНК и
последовательности прямого повтора длиной 25 п. н. делетированы
(pAL4404).
LBA4404(pBinl9)-штамм с бинарным вектором, содержащим селективный
маркерный ген nos-npt-II, неонкогенной плазмидой И У|г-помощником.
- Листья табака (только что полностью распустившиеся) от тепличных
растений 3-месячного возраста или размножаемых in vitro.
Растворы
{Ростовые среды для растений (приложение 2[П]) и антибиотики (приложение
2[IIIJ).]
- Среда для прямой регенерации побегов из листовых дисков (например,
MSD4X2 для табака) и та же среда, содержащая бактериостатические
антибиотики и/или агент для селекции трансформантов (агаризованная, по 25
мл в чашках Петри диаметром 9 см и по 6 мл в чашках диаметром 5 см).
122
Глава 2
Например, для трансформации листовых дисков табака и селекции Кш-
побегов:
MSD4X2+Cx (250 мкг/мл)+Кт (100 мкг/мл) 10 MSD4X2+Km (100 мкг/мл)
2
- Среда для укоренения с бактериостатическими антибиотиками (например,
MSO+Cx для табака), содержащая и не содержащая агент для селекции
трансформантов [по 60 мл в сосудах для культивирования Plantcon (Flow
Laboratories Ltd.), по 40 мл в банках на 200 мл Powder Round Jars (Beat-
son, Clark & Co. Ltd.) или no 25 мл в чашках Петри диаметром 9 см в
зависимости от размера побегов]. Например, для селекции Km-побегов
табака:
MSO+Cx (250 мкг/мл)
MSO+Cx (250 мкг/мл)+Km (100 мкг/мл)
- Среда для размножения трансформированных побегов [например, для табака
MSK по 60 мл в сосудах Plantcon (Flow Laboratories Ltd.) или по 40 мл в
банках на 200 мл (Beatson, Clark & Co. Ltg.)].
2.4.3. Методика
Tрансформация
1. Помещают молодые (только что полностью распустившиеся) листья табака в
плоский стерильный сосуд из пирекса и заливают 10%-ным раствором моющего
средства Domestos. Осторожно, чтобы не повредить листья, удаляют все
пузырьки с поверхности листьев путем осторожного помешивания стерильным
шпателем и оставляют на 15 мин3.'.
2. Тщательно ополаскивают 4 раза в 400 мл стерильной водопроводной воды.
3. Работая на стерильной белой кафельной плитке, удаляют все белые,
поврежденные при стерилизации участки листьев
и среднюю жилку, а затем разрезают лист на квадраты площадью 0,5-1 см2
с помощью нового стерильного скальпгля. Режущий инструмент следует
регулярно стерилизовать, погружая в спирт и обжигая в пламени горелки.
Перед тем как разрезать эксплантат, инструменты необходимо охладить.
Подготавливают достаточное количество материала, чтобы получить 200
кусочков листа, однако во избежание высыхания не следует нарезать сразу
весь материал. Достаточно за один раз нарезать кусочки листа на 2-3
чашки. Помещают по 10-12 кусочков листа на каждую из 20 чашек
Количество
чашек
MSD4X2
MSD4X2+Cx (250 мкг/мл)
20
10
Трансформация клеток двудольных растений
123
со средой MSD4X26) и герметизируют чашки липкой лентой Nescofilm.
Инкубируют чашки в течение 2 сут при 24-26 °С и низкой освещенностью
(2000 люкс, фотопернод 16 ч).
4. Эксперимент включает следующие контроли:
Контроли (8 чашек). Помещают по два неинокулированных контроля на
каждую из нижеперечисленных сред:
MSD4X2
MSD4X2+CX
MSD4x2-f-Cx4-Km
MSD4X2+Km
Инокуляции (12 чашек). Подготавливают по 6 чашек для каждого штамма
агробактерий. Помещают кусочки листа в разведенную 1 :50 суспензию
соответствующего штамма агробактерий, стряхивают избыток жидкости(r)* и
помещают их на исходную чашкуг)'д) с MSD4X2. Обматывают края чашки липкой
лентой Nescofilm и инкубируют (24-26°С) при слабой освещенности (2000-
4000 люкс) еще 2-4 дняд)'е). Регулярно проверяют чашки на бактериальную
контаминацию.
5. Послее> инкубации с агробактериями 8 течение 2 сут или при появлении
видимых бактериальных колоний переносят инокулированные кусочки листа на
следующие средыб)'д) (одна для каждого штамма):
3 чашки MSD4X2+Cx+Km
3 чашки MSD4x2+Cx ^
6. Инкубируют чашки при низкой освещенности (2000- 4000 люкс) (24-26 °С),
периодически наблюдая за развитием побегов и каллуса*).
7. На рис. 2.8 представлены результаты типичного эксперимента по
трансформации листовых дисков табака. Следующий этап процедуры
трансформации - срезание побегов, развившихся в различных условиях
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed