Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
лигированию и трансформации.
Ниже описана относительно простая методика, которая была
оптимизирована3' для штамма JM836) Е. coli и должна обеспечить частоту
трансформации в диапазоне 1-5хЮ7 трансфор-мантов/мкгв> ДНК- Клетки хранят
при -80°С в компонентном состоянии.
В приводимом примере колонии, содержащие нужную рекомбинантную
плазмиду, растут и имеют белую окраску на чашках со средой NA+Km+X-
GAL+ИПТГ. Устойчивость к Km обусловлена последовательностями pBinl9, а
белый цвет - инсерци-онной инактивацией гена р-галактозидазы в плазмиде
pBinl9 фрагментом CaMV-cat. Штамм JM83 имеет фенотип Lac~, и,
следовательно, колонии, несущие плазмиды с функциональным геном (3-
галактозидазы (т. е. pBinl9, не имеющие вставок), способны расщеплять X-
GAL и имеют голубую окраску [24].
Проведя трансформацию, рекомендуется ставить контроль для оцецки
эффективности трансформации путем добавления аликвоты компетентных клеток
к известному, ненасыщающему количеству неразрезанной плазмиды (например,
1 нг pBR322). Хорошо для контроля трансформации использовать плазмиду,
которая сходна по размеру с ожидаемой рекомбинантной плазмидой, чтобы
избежать недооценки эффективности лигирования^. В представленном примере
(табл. 1.4) контролем транс-> формации служит проба 1.
Агробактериальные Трансформирующие векторы растений 63
1.7.2. Обеспечение
Оборудование и приспособления
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Качалка с круговым вращением и регулируемой температурой на 37°С с
зажимами для стандартных и конических колб на 1 л.
- Водяная баня на 37 °С.
- Термостат на 37 °С.
- Полиалломерные центрифужные пробирки на 35 мл с полипропиленовыми
закручивающимися крышками (например, Nalgene, тип 3119).
- Среднескоростная центрифуга с охлаждением (например, Sorval RC-5B или
RT600B).
- Спектрофотометр, измеряющий поглощение в видимой области OD55o
(например, Perkin-Elmer).
- Одноразовые кюветы на 1 мл (Sarstedt).
- Небольшой сосуд Дьюара с жидким азотом.
- Кельвинатор на -80 °С.
Бактерии
- Селективные чашки, содержащие колонии рецигсиентных бактерий для
трансформации, например JM83 Ha'NA+12,5 мкг/ /мл Sm (разд. 1.3.4).
Растворыд>
- Лигированные пробы в соответствующем буфере (разд. 1.6).
- Контрольная неразрезанная плазмидная ДНК (например, pBinl9 в
концентрации 125 нг/мкл).
- ¦ф-бульон (2% ['вес на объем] бактотриптона Difco, 0,5% [вес на объем]
дрожжевого экстракта Difco, 0,4% [вес на объем] MgS04, 10 мМ КС1). На 1
литр:
Бактотриптон (Difco) 20,00 г
Дрожжевой экстракт (Difco) 5,00 г
MgS04-7H20 (BDH Analar) 4,00 г
КС1 (BDH Analar) 0,75 г
Стерилизуют автоклавированием и разливают по 5 мл в стерильные
пластиковые универсальные колбы и по 100 мл в конические колбы емкостью 1
л.
- TFB 1 (100 мМ RbCl, 50 мМ МпС12, 20 мМ ацетат калия, 10 мМ СаСЬ, 15%-
ный глицерин). На 50 мл:
1 М RbCl (Sigma) 5,00 мл
MnCl2-4H20 (Sigma) 0,495 г
Ацетат калия (BDH Analar) 0,147 г
64
Глава 1
750 мМ СаС12-2Н20 (Sigma) 0,67 мл
50%-ный глицерин (BDH Analar) 15,00 мл
Доводят pH до 5,8 ледяной уксусной кислотой, объем - Н20 и стерилизуют
фильтрованием.
- TFB 2 (10 мМ MOPS, pH 7,0; 10 мМ RbCl; 75 мМ СаС12; 15%-ный глицерин).
На 50 мл:
100 мМ MOPS (Sigma), pH 7,0 (доводят NaOH) 5,0 мл
1М RbCl (Sigma) 0,5 мл
750 мМ CaCl2-2H20 (Sigma) 5,0 мл
50%-ный глицерин (BDH Analar) 15,0 мл
Доводят объем дистиллированной НгО и стерилизуют фильтрованием.
- Чашки для селекции бактерий. В данном примере используют те же
селективные чашки, что и для трансформации век> тором рВin 19:
NA
NA+Km
NA+ Km-f-X-GAL-f-ИПТГ Для других векторов могут использоваться другие
антибиотики, а индикаторная система X-GAL/ИПТГ не всегда применяется.
1.7.3. Методика
Получение компетентных клеток Е. coli
1. Со свежеприготовленной чашки с бактериями (например, штаммом JM83) с
помощью стерильной петли засеваюте> одну колонию, ресуспендировав ее в 5
мл г|>бульона в стерильной стандартной пробирке, и инкубируют на качалке
при 37 °С в течение 2-3 ч.
2. Инокулируют эту исходную культуру в 100 мл предварительно нагретого
гр-бульона в конической колбе на 1 л и инкубируют на качалке при 37 °С до
достижения OD*^ 0,35, т. е. культура находится в логарифмической фазе
роста и содержит 3,5-4,0Х107 клеток/мл). На это обычно уходит
2-3 ч. Для определения OD550 через короткие промежутки времени
стерильной пастеровской пипеткой отбирают образцы культуры по 1 мл.
3. Переносят культуру в две закрытые крышкой центрифужные пробирки по 35
мл (2X35 мл) и охлаждают во льду 15 мин3).
4. Центрифугируют 5 мин при 2500 об/мин и 4 °С сливают супернатант.
5. Ресуспендируют клетки путем осторожного встряхивания в 10,5 мл
