Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
4 NA+Km 10-* 272
NA + Km 10-" 25
5 NA+Km 10° 69
6 Голубые Белые
NA + Km+X-GAL+ 10" 34 86
+ ИПТГ
NA + Km+X-GAL+ 10-1 2 9
+ ИПТГ
приводят к ожидаемому результату, поэтому любое отклонение
от ожидаемой частоты в какой-либо пробе должно указать стадию, на
которой произошел сбой.
Проба 1, Контроль трансформации для оценки эффективности трансформации
клеток неразрезанным вектором.
Проба 2. Оценка влияния на эффективность трансформации всех компонентов,
присутствующих в лигируемой смеси, кроме ДНК, по сравнению с числом
колоний в пробе 1.
Проба 3. Остаточный фоновый уровень трансформации рестри-цированной ДНК
вектора.
Проба 4. Оценка влияния присутствия лигазы в пробе на возрастание доли
трансформирующих молекул по сравнению с числом колоний в пробе 3.
Проба 5. При сравнении с числом колоний в пробах 3 и 4 этот контроль
показывает, что дефосфорилирование не снижает эффективности
трансформации, сохраняя фоновый уровень для линейных молекул вектора, и
предотвращает увеличение эффективности трансформации за счет
самолигирования немодифицированных молекул вектора.
Проба 6. Экспериментальный образец.
Лигирование по липким концам
I. Переносят векторную ДНК и ДНК вставки в м'икроцентри-фужную пробирку
Эппендорф в общем объеме до 15 мкл и помещают на лед.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 61
2. Добавляют в следующем порядке:
Десятикратный буфер для лигированияа> 2 мкл
100 мМ спермидин 1 мкл
20 мМ АТР 1 мкл
Дистиллированную НгО до 19 мкл
0,1 ед./мкл Т4-лигазы 1 мкл
3. Перемешивают и инкубируют при 4°С в течение ночиб).
Лигирование по тупым концам
Лигирование по тупым концам осуществляется практически так же, как и
лигирование по липким концам, за исключением того, что используют большее
количество лигазы и температура инкубации составляет 22, а не 4 °С.
1. Переносят векторную ДНК и ДНК вставки в микроцентри-фужную пробирку
Эппендорф в полном объеме до 15 мкл и помещают на лед.
2. Добавляют в следующем порядке:
Десятикратный буфер для лигирования3) 2 мкл
100 мМ спермидин I мкл
20 мМ. ATP I мкл
Дистиллированную НгО до 19 мкл 1,0 ед./мкл Тглигазы
I мкл
3. Перемешивают и инкубируют при 22 °С в течение ночиб>. Примечания
*> Буфер для лигирования следует однократно оттаять иа льду и
использовать немедленно.
в) Для трансформации из каждой реакционной смеси для лигирования к
компетентным клеткам необходимо добавить приблизительно по 10 нг ДНК. В
представленном примере объем лигированной пробы следует довести до 185
мкл дистиллированной НгО и 2 мкл из нее добавить к компетентным клеткам,
как описано в разд. 1.7.3.
1.7. Введение рекомбинантных плазмид в клетки Е. coli с помощью
трансформации
1.7.1. Основные положения
Впервые трансформацию Е. coli очищенной ДНК осуществили в 1970 г.
Мандел и Хига (Mandel, Higa [38]) путем инкубации бактерий с ДНК
бактериофага К в растворе СаС12 при 0°С. Для трансформации E.coli
плазмидой Коэн с соавторами (Cohen et al., [14]) использовал по существу
те же условия. Последующее развитие метода плазмидной трансформации
продолжалось эмпирически и современная процедура включает получение "ком-
62
Глава 1
петентных" клеток (т. е. компетентных для трансформации), которые можно
использовать непосредственно или хранить в замороженном виде в состоянии
компетентности, а затем использовать в нужный момент. Большинство методов
включает взаимодействие бактерий и плазмиды при низкой температуре в
присутствии дивалентных катионов, однако показано, что воспроизводимость
и эффективность трансформации усиливают некоторые дополнительные факторы.
К последним относятся используемый штамм и условия роста бактерий,
качество воды и реактивов, использованных для приготовления растворов,
чистота посуды и добавление диметилсульфоксида и дитиотреитола в буфер
для трансформации (см. [23])а>.
При трансформации Е. coli рекомбинантными плазмидами - продуктами
реакций лигирования - важно поставить контрольные опыты по трансформации
как для установления эффективности трансформации используемых
компетентных клеток, так и для проверки надежности селекции и методик
скрининга. Как указывалось ранее в разд. 1.6, при использовании для
трансформации лигированных смесей, а не интактных плазмид, обычно ставят
другие контроли, чтобы следить за эффективностью лигирования с
образованием кольцевых гетеродимеров и других продуктов реакции (табл.
1.4). В табл. 1.5 приведены результаты типичного эксперимента по
