Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 25

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 19 20 21 22 23 24 < 25 > 26 27 28 29 30 31 .. 184 >> Следующая

Доводят объем до необходимого дистиллированной НгО.
- 30 мМ Na-н'итрилотрехуксусная кислота. На 10 мл: растворяют 70,5 мг
двунатриевой соли (Sigma) в 10 мл дистиллированной НгО. Хранят при -20
°С.
- Фосфатаза из кишечника теленка (Calf intestinal phosphatase, BRL,
квалификации "для молекулярной биологии"), разведенная до требуемой
активности буфером для хранения3*.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 5]
1.5.3.2. Методика
1. Добавляют следующие компоненты в пробирку Эппендорф емкостью 1,5 мл:
Раствор ДНК (в Н20) 1 -17 мкл
10XCIP 2 мкл
Н20 до 19 мкл
Фосфатаза из кишечника теленка 1 мкл
2. Инкубируют 30 мин при 37 °С.
3. Останавливают реакцию добавлением 10 мкл 30 мМ нитрилотрехуксусной
кислоты. Инкубируют 45 мин при 65°С.
Если обработанную фосфатазой ДНК необходимо непосредственно добавить
в лигируемую смесь, то ее следует очистить, как описано в разд. 1.5.2.
Если после обработки фосфатазой требуется выделить специфический
фрагмент, то, остановив реакцию, смесь необходимо обработать так же, как
после полного рестрикционного гидролиза согласно методикам, приведенным в
разд. 1.5.4 или 1.5.5.
Примечание
*> Для удаления 5'-коицевых фосфатных групп 1 пмоля концов (в 1,6 мкг
фрагмента размером 5 т. п. и. содержится 1 пмоль концов) требуется 0,05
ед, ферментативной активности. Важно, чтобы в реакции участвовало
минимальное количество фермента, поскольку возможные примеси экзонуклеаз,
присутствующие в небольших количествах в препаратах этого фермента, могут
гидролизовать одноцепочечные липкие концы.
1.5.4. Электроэлюция рестрикционных фрагментов из агарозных гелей
1.5.4.1. Обеспечение
Оборудование и приспособления
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [ IJ).
- Оборудование для электрофореза в агарозном геле (разд.
5.3.2).
- Камера для электроэлюции (например, LKB, Extraphor).
- УФ-трансиллюминатор (например, UV Products, модель TS-36).
- Защитные очки и маска для работы с ультрафиолетом.
- Пинцет с тупыми концами.
Растворы
- Растворы для электрофореза в агарозном геле (разд. 5.3).
- Высокосолевой буфер (3 М ацетата "атрия, pH 7,9; 0,01% бром фенолов
ого синего).
52
Глава 1
На 100 мл: растворяют 40,82 г трехводного ацетата натрия (BDH Analar)
в 50 ,мл дистиллированной НгО. Доводят pH до 7,9 ледяной уксусной
кислотой (BDH Analar), добавляют 10 мг бромфенолового синего (Pharmacia)
и доводят объем до 100 мл. Автоклавируют и хранят при комнатной
температуре.
- Буфер для электрофореза (10 мМ трис-НС1, pH 8,0; 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ
NaO). На 1 л концентрированного десятикратного раствора:
2 М трис-НС1, pH 8,0 (см. разд. 1.4.2) 50 мл
0,5 М ЭДТА 20 мл
5 М NaCl 1 мл
Дистиллированная НгО 929 мл
Полученный раствор хранят как десятикратный исходный раствор при
комнатной температуре и разводят до рабочей концентрации (в десять раз)
непосредственно перед употреблением.
- Этанол (-20 °С).
- 70%-ный этанол.
- Стерильная дистиллированная НгО.
I.5.4.2. Методика
1. С помощью электрофореза в атарозном геле фракционируют
реетрицированную ДНК, как описано в разд. 5.3. Количество расщепленной
ДНК и условия электрофореза необходимо подобрать таким образом, чтобы
получить хорошее отделение нужного фрагмента от других фрагментов ДНК и
достаточное его количество для последующего лигирования (разд. 1.6.1).
2. Помещают гель на УФ-траноиллюминатор и идентифицируют требуемую
зону.
3. С помощью острого скальпеля вырезают нужные зоны (будьте
осторожны, чтобы не-повредить ультрафиолетовый фильтр) и переносят тонким
пинцетом в стерильные пластиковые пробирки.
4. Подготавливают камеру для электроэлюции согласно инструкции
изготовителя.
5. Разрезают фрагмент(ы) геля на небольшие кусочки (кубики 1-3 мм)
и помещают в круглые ячейки камеры для элюции.
6. Проводят электрофорез в течение 45 мин при 150 В, в результате
которого ДНК задерживается в высокосолевом буфере.
7. С помощью микропипетки на 100 мкл переносят высокосолевой буфер
в объеме 300 мкл в пробирки Эппендорф.
8. Добавляют 1 мл холодного (-20 °С) этанола и охлаждают 15 мин в
бане сухой лед/этанол.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 5'
9. Центрифугируют 15 мин при 12000 об/мин и сливают супернатант.
10. Добавляют 500 мкл 70%-кого этанола, перемешивают и снова
центрифугируют 5 мин при 12 000 об/мин, сливают супернатант и высушивают
под вакуумом.
11. Растворяют в соответствующем объеме Н20 для добавления в лигирующую
смесь (разд. 1.6).
1.5.5. Очистка специфических рестрикционных фрагментов путем
фильтрования центрифугированием
1.5.5.1, Обеспечение
Оборудование и приспособления
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
Предыдущая << 1 .. 19 20 21 22 23 24 < 25 > 26 27 28 29 30 31 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed