Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 34

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 28 29 30 31 32 33 < 34 > 35 36 37 38 39 40 .. 184 >> Следующая

предполагаемых рекомбинантных плазмид, представляющих лигирование ЯшсЯП-
фрагмента длиной 4,6 т. п. н. СаМV-cat в Hindlll-сайт вектора для
трансформации растений pBinl9 (рис. 1.11). Как видно из рис. 1.11,Л,
расщепление ми-ни-препарата ДНК плазмиды рестриктазой ?cc>RI дает
информацию как о числе, так и об ориентации вставок, содержащихся в
конструкции. Ожидаемые размеры рестрикционных фрагментов для нужной
конструкции составляют либо 11,7, 2,25 и
0,65 т. п. н., либо 12,25, 1,70 и 0,65 т. п. н. Такие фрагменты можно
видеть на рис. 1.11,5 - дорожки 2-5, 7-9 и 10 соответственно. По
образованию дополнительных зон или отсутствию ожидаемых определяют, что
рекомбинантная плазмида имеет неправильную структуру, ,и клоны, несущие
такие плазмиды, можно выбросить.
Примечания
*> Обычно наносят по 0,1 мкг ДНК для каждой ожидаемой зоны, однако в геле
можно увидеть и 40 нг. б> К каждой расщепляемой пробе добавляют по 2 мкл
раствора предварительно обработанной прогреванием РНКазы A (BRL) и
инкубируют при комнатной температуре 2 мин. Добавляют 5 мкл буфера для
нанесения на гель и держат во льду до нанесения иа агарозный гель для
анализа. *) Обычно в качестве маркеров размера используют ДНК фага X,
разрезанную Hindlll или ?coRI. Мол. массы соответствующих рестрикционных
фрагментов приведены в разд. 5.3.3 (примечание в).
1.10. Конъюгационный перенос рекомбинантных плазмид в агробактерии
1.10.1. Основные положения
Конъюгацию, необходимую для переноса нужной плазмиды из Е. coli в
агробактерию, наиболее удобно осуществить с помощью трехродительского
скрещивания [55]. Обычно применя-
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 73
ют две системы конъюгации - первая для промежуточных векторов на основе
репликона ColEl, используемых в сочетании с векторами коинтегративного
типа, и вторая для реплнкона RK.2, на основе которого сконструированы
многие бинарные векторы. Для обеспечения функций мобилизации (mob) и
переноса (ira), действующих в транс-положении, используют плазмиды-
помощники конъюгации ("хелперные" плазмиды), специфичные для репликонов
обоих типов, либо на отдельных реп-ликонах, либо интегрированные с
хромосомой в специальных хозяйских штаммах агробактерий [36]. Для того
чтобы система конъюгации функционировала, клонирующие векторы должны
содержать специфичное начало переноса ("ориджин" - оп'Т) и сайт активации
(bom), на которые действуют продукты генов tra и mob.
Репликоны Col El
Во время трехродительского скрещивания плазмиды-помощники (обычно
pGJ28 и pR64drd 11) с высокой частотой переносятся в штамм Е. coli,
несущий рекомбинантную плазмиду. Плазмиды-помощники затем обеспечивают
перенос в агробактерии всех трех плазмид, происходящий с частотой около
10 "4-10~5 (рис. 1.5, В). В трехродительоком скрещивании все. три штамма
смешивают вместе и селектируют желаемые агро-бактерии-трансконъюганты. В
другом случае можно осуществить эту процедуру путем проведения сначала
двухродительского скрещивания между штаммом Е. coli, несущим
промежуточный вектор, и штаммом Е. coli, несущим плазмиду-помощник,
прежде чем проводить второе скрещивание между первым трансконъюгантом и
штаммом агробактерий, несущим функции Dir-помощника. В системах с ^мс-
действующей шг-областью (например, pGV3850) последовательности вектора
сохраняются благодаря гомологичной рекомбинации с резидентной плазмидой-
помощником вирулентности3). Образование коинтегрантов происходит с
довольно низкой частотой, и обычно в результате образуется гораздо меньше
стабильных трансконъюгантов с векторами цис-типа, чем с бинарными
векторами.
Репликоны RK2
В большинстве клонирующих векторов бинарных систем ио пользуют начало
репликации RK2 и для их конъюгационного переноса обычно используют
функции помощника плазмиды PRK.2013 [18]. Мобилизация и в этом случае
иногда проводится с помощью двух двухродительских скрещиваний, а чаще - с
помощью одного трехродительского скрещивания. Частота мобилизации обычно
составляет около 10~2-10-3 и, следовательно, более эффективна, чем
частота, достигаемая для репли-
74
Глава 1
конов Col El. В отличие от промежуточных векторов репликонц RK2
сохраняются в агробактериях (при селекции) без образования коинтегрантов,
и, таким образом, трансконъюганты отбираются с гораздо более высокой
частотой.
Многие часто используемые акцепторные штаммы агробактерий содержат
локализующийся в хромосоме ген устойчивости к рифампицину (Rf), а
большинство клонирующих векторов обоих типов (табл. 1.1 и 1.2) содержат
маркеры устойчивости к антибиотикам прокариотического происхождения,
отличным от Rf, в том числе Km, Sm, Теи Am. Таким образом,
трансконъюганты агробактерий, содержащих рекомбинантные
последовательности, можно селектировать как колонии, резистентные к Rf, а
также к Km, Sm, Тс и СЬ. На практике могут происходить некоторые
перестройки или делеции перенесенных последовательностей, и, таким
образом, проверка конструкций в трансконъюгантах (разд. 1.11 и 1.12)-это
Предыдущая << 1 .. 28 29 30 31 32 33 < 34 > 35 36 37 38 39 40 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed