Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
фенотипический скрининг на присутствие вставок при клонировании в
плазмидах, содержащих соответствующие lacZ конструкции, такие, как в pBin
19 и pUC18.
¦з) Максимальное число трансформантов, получаемое при использовании
данной партии компетентных клеток, зависит от двух факторов - доли
компетентных клеток в препарате и эффективности их трансформации. Долю
компетентных клеток можно определить путем сравнения числа
трансформантов, полученных при насыщающем количестве плазмиды (например,
500 пг), по отнешению к общему количеству выживших клеток в
использованной для трансформации аликвоте. Для приведенной выше методики
это составит от 1,5 до 2,0%. Эффективность трансформации можно определить
по числу трансформантов, полученных при ненасыщающих количествах ДНК
(например, 50 пг), для приведенной выше методики она составляет 107-10s
трансформантов/мкг ДНК. т> Поскольку эффективность трансформации
выражается в единицах, отнесенных к весу, а не к количеству молекул,
кажущаяся эффективность трансформации убывает линейно с увеличением
размера плазмиды1.
д) Эффективность трансформации зависит от чистоты реактивов и воды -
всегда используйте наиболее чистые.
е) Старайтесь не захватить агар, поскольку он ингибирует трансформацию.
ж) Число жизнеспособных клеток пропорционально OD550 в широком диапазоне,
а коэффициент пропорциональности зависит от штамма бактерий.
а) Очеиь важно, чтобы клетки, если их однажды охладили, в дальнейшем
(насколько это возможно) находились во льду; переносить их нз ледяной
бани можно только для таких операций, как перемешивание, которое следует
проводить быстро и осторожно.
а) Это необходимо, чтобы гены устойчивости к антибиотикам, которые ввели
посредством трансформации, успели экспрессироваться.
Мокрый агар ингибирует формирование колоний при инкубации,
1.8. Быстрое выделение небольших количеств плазмидной ДНК Е. coli
1.8.1. Основные положения
Получение мини-препаратов плазмид основано на тех же •самых
принципах, что и описанное выше выделение плазмид в •больших объемах. Во
многих лабораториях успешно использовались варианты данной методики для
широкого диапазона
1 По нашему опыту эта зависимость не линейная: при увеличении
размера плазмиды вдвое эффективность трансформации падает лримерно на
порядок. - Прим. ред. пер.
12,25
Е ЕЕ
11-70 1,70 0,65 11.70
т.п.н.
12.25
11,70
4,50
3,95
3,40
2.25
1,70
0,65
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 69
комбинаций плазмид/бактериальных штаммов. Стадия очистки в градиенте
плотности для экономии времени опущена, и, следовательно, получаемый
препарат ДНК обычно недостаточно чист, чтобы его можно было использовать
для каких-либо иных целей, кроме проверки правильности конструирования
плазмид в трансформированных бактериях с помощью рестрикционного анализа
(разд. 1.9) или при необходимости блоттинг-гибриди-зации по Саузерну. В
случае векторов для трансформации растений необходимо проверять структуру
рекомбинантных плазмид в Е. coli, прежде чем перенести их в агробактерии
с помощью конъюгации (разд. 1.10). В разд. 1.9 приведена схема
рестрикционного анализа мини-препаратов плазмид (рис. 1.11), выделенных
из случайно выбранных колоний трансформантов штамма JM83,
предположительно содержащих рекомбинантные плазмиды pBinl9 (т. е. белые
Ктг-колонии на чашках со средой NA+Km+X-GAL+ИПТГ).
1.8.2. Обеспечение
Оборудование и приспособления
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение
- Качалка на 37 °С с зажимами для универсальных пробирок (например,
Gallenkamp).
- Баня сухой лед/этанол.
Растворы
- NB+селективные антибиотики для используемых штаммов бактерий (по 5 мл
в стандартных пробирках).
- Лизирующий раствор, см. разд. 1.4.2.
- Щелочной ДСН, см. разд. 1.4.2.
- 3 М ацетат натрия, pH 4,8. На 400 мл: Растворяют 98,44 г ацетата
натрия (BDH Analar, безводный) в 200 мл НгО. До-
- водят pH до 4,8 ледяной уксусной кислотой (BDH Analar),
Рис. 1.11. Использование рестриктазы ЕсоШ для анализа предполагаемых
конструкций pBinl9CaMV-catf в Е. coli.
Л. Предполагаемые размеры фрагментов после расщепления ЕсоШ
рекомбинантных плазмид, образующихся в результате единичной вставки
фрагмента в двух возможных ориентациях и четырех возможных иариантов
лигирования двух таидемных вставок в исходном векторе.
Результаты расщепления ЕсоШ различных миии-препаратов ДНК в
эксперименте по лигированию. Дорожки 2-5 и 7-9 содержат фрагменты,
соответствующие предсказываемой конфигурации 2; фрагменты дорожки II
соответствуют предсказываемой конфигурации 1. В дорожке 6 можно видеть
дополнительный фрагмент длиной 7 т. п. н., а дорожка 10 ие содержит ни
одного нз ожидаемых фрагментов. Конструкции в последних двух дорожках,
видимо, °ретерпели делеции и/или другие перестройки ДНК в процессе
