Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
белков из экстракта смесью фенол/хлороформ и концентрирование нуклеиновых
кислот путем осаждения этанолом. Описанная ниже методика успешно
использовалась для ряда штаммов агробактерий. В следующем разделе 1.12
представлены результаты расщепления суммарной ДНК. агробактерий
ферментами рестрикции и примеры анализа по Саузерну последовательностей
плазмид, содержащихся в различных мини-препаратах тотальной нуклеиновой
кислоты агробактерий.
1.11.2. Обеспечение Оборудование и приспособления
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1[1]).
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 77
-- Стерильные зубочистки.
Бактерии
- Предполагаемые трансконъюганты из трехродительских скрещиваний.
- Реципиентный штамм агробактерий в качестве контроля (например,
LBA4404).
Растворы
- NB+селективные антибиотики (по 5 мл в стандартных пробирках) для
выращивания трансконъюгантов и контрольных штаммов (например, см. разд.
1.10.2).
- 5%-ный "саркозил" ("Sarkosyl", Sigma, N-lauroylsarcosine, натриевая
соль) в ТЭ-буфере.
- 5 М NaCl (292,2 г/л).
- ТЭ-буфер; см. разд. 1.4.2.
- Раствор проназы [5 мг/мл проназы (Sigma) в ТЭ-буфере]. Предварительно
необходимо подготовить раствор путем са-мопереваривания проназы в течение
2 ч при 37 °С и хранить при -20 °С.
- Смесь фенол/хлороформ (1: 1), см. разд. 1.5.2.1.
- 100- и 70%-ный этанол (-20°С).
1.11.3. Методика (модифицирована по [17])
1. С помощью стерильной зубочистки переносят отдельную колонию
агробактерий в 5 мл NB, содержащего селективные антибиотики, и инкубируют
в течение ночи на качалкеа> при 28 °С.
2. Переносят 1,5 мл культуры в микроцентрифужную пробирку и собирают
клетки путем центрифугирования 5 мин при 12 000 об/мин.
3. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки в 300 мкл ТЭ-буфера.
4. Добавляют 100 мкл 5%-ного саркозила в ТЭ-буфере и перемешивают.
5. Добавляют 150 мкл раствора проназы. (5 мг/мл) и перемешивают.
6. Инкубируют 1 ч при 37 °С.
7. Добавляют 500 мкл смеси фенол/хлороформ и с помощью микродозатора
Gilson Р1000 на 1 мл осторожно пипетиру-ют смесь 5 раз для снижения
вязкости бактериального лизата.
8. Разделяют водную и органическую фазы путем центрифугирования при 12
000 об/мин в течение 5 мин.
9. Переносят водный супернатант в чистую пробирку и трижды проводят его
экстракцию. Для этого добавляют 500 мкл
78
Глава 1
смеси фенол/хлороформ, осторожно перемешивают фазь& с образованием
эмульсии, центрифугируют при 12 ООО об/мщ* 5 мин и переносят верхнюю
водную фазу в чистую пробирку.
10. Оценивают объем водной фазы и добавляют 0,05 объема 5 М NaCl до
конечной концентрации 0,25 М. Добавляют
3 объема холодного (-20°С) этанола и оставляют при -20 °С на 1-2 ч.
11. Собирают нуклеиновую кислоту с помощью центрифугирования при 12 000
об/мин в течение 10 мин. Сливают супернатант, промывают осадок 1 мл 70%-
ного этанола и снова* собирают нуклеиновые кислоты центрифугированием (12
000 об/мин, 10 мин).
12. Осторожно удаляют супернатант и немного подсушивают осадок под
вакуумом6'.
13. Ресуспендируют осадок в 50 мкл H&Oi.
Примечания
•> Поскольку время генерации агробактерий обычно составляет около 2 ч*. а
Е. coli - около 20 мин, для достижения требуемого роста клеток каю жидкие
культуры, так и. чашки с агробактериями можно инкубировать-в течение 2
сут.
6) Не высушивайте полностью осадок нуклеиновой кислоты, поскольку; в этом
случае его практически невозможно ресуспендировать в воде.
1.12. Рестрикционный гидролиз тотальной ДНК агробактерий
1.12.1. Основные положения
Рестрикционный гидролиз ДНК и метод блоттинг-гибриди*-зации по
Саузерну более подробно описаны в гл. 5. Однако в" настоящем разделе мы
остановимся на некоторых частных аспектах, специфически связанных с
анализом векторных последовательностей в агробактериях.
Рестрикционный гидролиз суммарной ДНК из агробактерш(r) вместе с
методом боттинг-гибридизации по Саузерну можно использовать не только для
доказательства образования коинте-грата специфичной чужеродной
последовательности ДНК ст Ti-плазмидным вектором цис-типа или сохранения
ее в бинар^ ном векторе транс-типа, но и для определения организации
перенесенной ДНК. Для анализа необходимо выбрать фермент,, дающий
характерный набор рестрикционных фрагментов. В случае коинтегративных
векторов важно подобрать рестрик-тазу и пробы для гибридизации, с помощью
которых можно-визуализировать как внутренние последовательности, так №
фрагменты стыков. Как и при любой методике блоттинг-гибри-
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 79
дизации по Саузерну, в гель необходимо внести контрольные образцы ДНК,
например исходные векторные молекулы (отрицательный контроль) и очищенную
плазмиду, из которой была получена вставка ДНК (положительный контроль),
а также радиоактивно меченные маркеры мол. массы (см. гл. 5).
Как и мини-препараты плазмид Е. coli, суммарная ДНК агробактерий может
