Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
холодного TFB 1, объединяют в одну пробирку и инкубируют на льду в
течение 90 мин.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 65
6. Центрифугируют 5 мин при 25 ООО об/мин и 4 °С и сливают супернатант.
7. Осторожно ресуспендируют клетки в 2,8 мл холодного TFB 2 и отбирают
аликвоту объемом 200 мкл в микроцентрифуж-ную пробирку Эппендорф на 1,5
мл.
Эти клетки приобрели компетентность, и их можно либо немедленно
использовать для трансформации, либо быстро заморозить в жидком азоте и
хранить несколько месяцев при -80 °С
при небольшом снижении эффективности трансформации.
Трансформация компетентных клеток Е. coli
1. Оттаиваю г замороженные компетентные клетки при комнатной температуре
до момента начала плавления и инкубируют на льду 10 мин. Можно
использовать и свежеприготовленные компетентные клетки.
2. Добавляют их к 10 нг ДНК в максимальном объеме 10 мкл НгО (например, 2
мкл десятикратно разведенной лигированной смеси из разд. 1.6, табл. 1.2),
осторожно перемешивают и инкубируют во льду 20 мин.
3. Прогревают клетки (тепловой шок), инкубируя пробирки в водяной бане на
37 °С в течение 60 с и немедленно переносят в лед еще на 2 мин.
4. Добавляют 800 мкл гр-бульона и инкубируют на качалке при 37 °С в
течение 50 мини>.
5. Осаждают клетки центрифугированием в течение 30 с в микроцентрифуге,
удаляют супернатант и ресуспендируют клетки в 100 мкл ф-бульона.
в. Готовят последовательные десятикратные разведения суспензии клеток до
10"6, на каждом этапе добавляя 10 мкл клеток к 90 мкл ¦ф-бульона. С
помощью стерилизованного в пламени горелки и охлажденного стеклянного
шпателя наносят (втирают) содержимое пробирок, содержащих разведения 10~6
и 10~5, на поверхность чашек с NA (это контроль выживаемости клеток) и
разведения 10~2, 10-1 и 10° на чашки с NA, содержащие соответствующие
селективные антибиотики (нашример, Km в случае pBinl9), и на чашки,
содержащие как антибиотики, так и X-GAL+ИПТГ, при использовании векторов,
имеющих систему скрининга рекомбинантных трансформантов по LacZ (табл.
1.5).
7. Подсушивают чашки в потоке стерильного воздуха в ламинарном боксек>.
8. Инкубируют чашки в перевернутом виде (крышкой вниз) при 37 °С в
течение ночи.
9. Оценивают общее число колоний, выбирая участок чашки, содержащий
разумное число колоний (например, 50-500), подсчитывая в нем число
колоний и умножая на соответст-
66
Глава 1
вующий коэффициент. Подсчитывают частоту трансформации на чашках
контроля трансформации (число трансфор-мантов/мкг ДНК), чтобы убедиться,
что эффективность-трансформации достаточно высока. В табл. 1.5 приведены
результаты типичного эксперимента лигирования/трансформации, в котором
Hindlll фрагмент плазмиды pUC18CaMVCAT длиной 4,6 т. п. н. встраивали в
разрезанную Hindlll и де-фосфорилированную pBinl9 с образованием
pBinl9CaMV-cat (разд. 1.6.3).
Выживаемость клеток:
186X10 , - з 7^{Q7 КЛеток/мл.
В
Частота трансформации для pBinl9:
698Х102Х--¦ = 5,6X10(r) трансформантов/мкг.
12,5
Ингибирование трансформации другими компонентами лигированной смеси в
процентах:
698 ~ 659 XI00 = 6 %.
698 74
Эффективность трансформации рестрицированной pBinl9:
---------X ЮО = 0,08%.
659X102 ^
Эффективность самолигирования pBinl9:
2-72xl°a-xl00 = 41 %.
659 X Ю2
Ингибирование самолигирования с помощью дефосфорилирова-ния:
272хЮ2 - 69 1 00 = 99 0/о>
272X Ю2
Общее число рекомбинантных колоний/мкг лигированной ДНК*
86Х-- X-- = 8600 колоний/мкг.
74 10 74 925
Примечания
а> Следует иметь в виду, что на эффективность трансформации наибольшее-
влияние оказывает следующее:
1) OD550, при которой осаждают клетки.
2) Быстрое замораживание компетентных клеток в жидком азоте.
3) Добавление ДНК. в наименьшем возможном объеме Н20.
4) Тепловой шок при 37 °С, а не при традиционной температуре 42 0С.
Если данную методику необходимо оптимизировать для другого штамма, а ие
JM83 или эффективность трансформации ие достигает указан-
Агробактериальные трансформирующие векторы растений_____________67
ного уровня, тогда наибольший успех может быть достигнут при
варьировании вышеперечисленных условий,
в) Многими исследователями доказано, что штамм JM83 удобен для
трансформации по следующим причинам.
1) Как правило, он дает высокие частоты трансформации.
2) При выделении плазмид как в больших, так и в малых объемах он
обеспечивает значительный выход плазмиды.
3) Штамм несет хромосомный ген Sm-резистентности, который позволяет
вести селекцию против контаминирующих бактерий.
4) Этот штамм имеет фенотип гес А-, что позволяет эффективно и
воспроизводимо клонировать рекомбинантные ДНК.
5) Этот штамм несет мутацию lac-, в результате чего возможен
