Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 33

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 27 28 29 30 31 32 < 33 > 34 35 36 37 38 39 .. 184 >> Следующая

лигирования.
70
Глава 1
затем объем водой - до 400 мл, автоклавируют и хранят при комнатной
температуре.
- ТЭ-буфер, см. разд. 1.4.2.
- 2 М ацетат натрия, pH 5,6 - см. разд. 1.4.2.
- Фенол/хлороформ (1:1), см. разд. 1.5.2.1.
- Хлороформ.
- Этанол (-20 °С).
I.8.3. Методика (модифицирована по [10])
1. Засевают отдельные колонии, несущие предполагаемые рекомбинантные
плазмиды, в 5 мл NB, содержащего селективные антибиотики (например, 50
мкг/мл Km для pBinl9CaMV-caf в Е. coli), и инкубируют на качалке в
течение ночиа> при 37 °С.
2. Разливают по 1,5 мл суспензии клеток в микроцентрифуж-ные пробирки и
собирают клетки центрифугированием при 12 000 об/мин в течение 2 минб>.
3. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки в 100 мкл лизирующего
раствора. Оставляют во льду на 5 мин.
4. Добавляют 200 мкл щелочного ДСН и осторожно перемешивают до тех пор,
пока суспензия не станет прозрачной и вязкой. Оставляют во льду на 5 мин.
5. Добавляют 150 мкл 3 М ацетата натрия (pH 4,8) и перевертывают
пробирку несколько раз, пока не образуется комок ДНК. Оставляют во льду
на 10 мин.
6. Центрифугируют в микроцентрифуге 10 мин (в результате должен
образоваться прозрачный надосадок) и переносят супернатант в новую
пробирку.
7. Добавляют к супернатанту 1 мл холодного (-20 °С) этанола, хорошо
перемешивают и помещают в баню сухой лед/этанол на 15 мин.
8. Собирают преципитат путем центрифугирования при 12 000 об/мин
(максимальная скорость микроцентрифуги) 10 мин.
9. Осторожно сливают супернатант и растворяют осадок в 100 мкл ТЭ-
буфера.
10. Добавляют 100 мкл смеси фенол/хлороформ, хорошо перемешивают и
разделяют фенольную и водную фазы путем центрифугирования в течение 10
мин при 12 000 об/мин.
II. Переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку, добавляют 100
мкл хлороформа, перемешивают и разделяют две фазы с помощью
центрифугирования при 12 000 об/мин в течение 2 мин.
12. Отбирают и выбрасывают нижнюю фазу, содержащую хлороформ, к
оставшемуся супернатанту добавляют 10 мкл
2 М ацетата натрия (pH 5,6).
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 71
13. Добавляют 1 мл холодного (-20 °С) этанола, перемешивают и инкубируют
15 мин в бане сухой лед/этанол.
}4. Собирают преципитат с помощью центрифугирования при 12 ООО об/мин 10
мин и удаляют супернатант. Добавляют 1 мл 70%-ного этанола и снова
центрифугируют 5 мин.
15. Сливают надосадок, высушивают ДНК под вакуумом и растворяют в 50 мкл
НгОв).
Примечания
") Достаточно 8 ч для роста.
") Все растворы, кроме щелочного ДСН, следует держать во льду.
") Полученный препарат ДНК должен быть достаточно чистым для гидролиза
рестриктазами; 10 мкл достаточно для каждой рестриктируемой пробы.
1.9. Анализ мини-препаратов ДНК с помощью рестрикционного гидролиза и
электрофореза в агарозном геле
1.9.1. Основные положения
Использование рестрикционных ферментов для расщепления ДНК и анализ
полученных фрагментов с помощью электрофон реза в агарозном геле подробно
обсуждаются в разд. 5.2 и 5.3, поэтому в данном разделе мы на этих
вопросах останавливаться не будем.
Для расщепления большинства препаратов плазмидных ДНК требуется в 2-3
раза больше ферментов, чем для разрезания эквивалентного количества
очищенной стандартной ДНК (например, ДНК бактериофага А,), по отношению к
которой обычно определяют ферментативную активность рестриктаз. Мини-
препараты плазмид могут содержать примеси, которые уменьшают активность
этих ферментов, а концентрация плаз-мидной ДНК вместе с примесью
хромосомной ДНК варьирует. Таким образом, мини-препараты ДНК обычно
гидролизуют в присутствии (5-10)-кратного избытка фермента в течение 1 ч
или (2-3)-кратного избытка в течение нескольких часов. Рестрикционное
расщепление плазмид часто дает фрагменты, Вместе с которыми мигрируют,
затрудняя их идентификацию, большие количества РНК, неизбежно
загрязняющие мини-препараты. Такие фрагменты можно визуализировать путем
обработки препаратов перед электрофорезом3) РНКазой6', не содержащей
примесей ДНКаз.
При анализе предполагаемых рекомбинантных векторных плазмид для
трансформации растений, чтобы убедиться, действительно ли получена
желаемая вставка, особое внимание еле-
72
Глава 1
дует уделить подбору рестрикционных ферментов. При обработке ими плазмиды
с желаемой конфигурацией вектора/вставки необходимо получить уникальный и
легко идентифицируемый набор фрагментов. Для этого обычно необходимы
подробные рестрикционные карты как вектора, так и вставки. Если это
возможно, следует гидролизовать исходную родительскую плазмиду таким
образом, чтобы получить фрагменты, соответствующие некоторым из
фрагментов, получаемым при рестрикции рекомбинантной плазмиды, поскольку
комиграция фрагментов всегда более доказательна, чем определение размера
путем сравнения с маркерами мол. массыв).
В данном разделе анализ мини-препаратов представлен на примере
Предыдущая << 1 .. 27 28 29 30 31 32 < 33 > 34 35 36 37 38 39 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed