Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
быть не очень чистой и концентрация ее неизвестна. Обычно 10 мкл
достаточно для рестрикционного расщепления и блоттинга; следует отметить
следующие моменты.
- Убедитесь, что нуклеиновая кислота полностью растворилась. Это
позволит избежать вязкости при нанесении на агарозный гель и трудностей с
рестрикционным расщеплением. При успешном расщеплении после электрофореза
получается размазанная по всей длине дорожки полоса ДНК, содержащая
отдельные видимые зоны (рис. 1.12, А, дорожки
3-8).
- Неполное расщепление - часто встречающееся затруднение. Чтобы решить
эту проблему, можно сделать следующее:
A. Увеличить конечный объем реакционной смеси.
Б. Увеличить количество используемой рестриктазы.
B. Увеличить время рестрикции (реакцию можно оставить на ночь, если это
удобно).
Г. Провести дополнительную депротеинизацию препарата смесью
фенол/хлороформ, переосадить нуклеиновую кислоту этанолом и отмыть 70%-
ным этанолом перед расщеплением ферментами.
На рис. 1.12, Л показан типичный результат анализа, основанного на
нашем примере. В дорожках 3-7 (рис. 1.12, Л) находятся расщепленные
HindlU ДНК из трансконъюгантов пяти трансформантов Е. coli (см. рис.
1.11), для которых было показано, что они несут правильные конструкции.
Дорожка 2 ¦содержит #?пс?Ш-фрагмент CaNW-cat (положительный контроль
гибридизации), а дорожка 8 - расщепленную Hindlll ДНК LBA4404
(отрицательный контроль). Отметим, что во всех дорожках ДНК
рестриктирована, видны многочисленные дискретные полосы и содержится
небольшое количество высокомолекулярной ДНК, остающейся после
электрофореза в начале геля (вблизи ячеек для нанесения ДНК)- Плохо
расщепленная ДНК имеет тенденцию тянуться, быть вязкой, дает мало
дискретных полос (если вообще дает) и состоит главным образом из
высокомолекулярных фрагментов.
Гель (рис. 1.12, Л) переносили с помощью блоттинга по Саузерну на
микропористый фильтр и гибридизовали с cat-специфичной пробой, как
описано в гл. 5. Полученный радиоавтограф представлен на рис. 1.12, Б.
Как в положительном контроле, так и в дорожках 3-7 можно видеть сильную и
специ-
80
Глава I
фичную гибридизацию, тогда как в ДНК LBA4404 (дорожка 8) таковая не
наблюдается. При расщеплении Hindlll образует фрагмент, который мигрирует
так же, как HmdIII-фрагменг СаМV-cat и гомологичен ему. Следовательно,
можно заключить, что все проверенные трансконъюганты содержат желаем мые
конструкции, которые, видимо, сохранили свою целостность во время
процесса конъюгации.
Рис. 1.12. Анализ плазмиды pBinl9CaMV-ca^ в LBA4404 с помощью блоттинг-
гибридизации по Саузерну.
А. Агарозный гель после окрашивания бромистым этидием. Дорожка 1-мар-керы
мол. массы, состоящие из ДНК фага к, разрезанной Hindlll и HindiЫ-f-
+?coRI. 2. ЯгяйШ-фрагмент СаМ V-cat размером 4,6 т. п. н. 3-7.
Расщепленные HindIII ДНК из различных клонов трансконъюгаитов. 8. ДНК.
LBA4404"
расщепленная Hindlll.
Б. Радиоавтограф геля (Л) после переноса я гибридизации с са^-
специфичнои пробой (описание пробы см. в разд. 3.2.3.2).
Приложение 1 [I]
Обычное оборудование для молекулярно-биологических
исследований
- Автоматические микропипетки Gilson, Р20, Р200; РГ0ОО (Агг-chem Ltd.)
- Наконечники для пипеток Gilson в штативах (автоклавиро-ванные и
высушенные):
Желтые (Р20, Р200)
Синие (Р1000)
I Р СО СП > I I
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 81
- Настольная микроцентрифуга (MSE Scientific Instruments. Ltd.).
- Микроцентрифужные пробирки Эппендорф на 1,75 мл, стерилизованные в
закрытом фольгой стакане из пирекса на* 500 мл (W. Sarstedt & Co.).
- Ведерко для льда и измельченный лед.
- Плавающий штатив из полистирола для пробирок типа Эпт пендорф.
- Водяные бани для неподвижной инкубации (Gallenkamp).
- Кипящая водяная баня (Gallenkamp).
- Морозильники, -20 и -80 °С.
- Холодильник.
- Электронные весы и чашки для взвешивания.
- Магнитные мешалка и палочки.
- Миксер (встряхиватель для пробирок).
- Шпатели, пинцеты, скальпели, ножницы и т. п.
- Фломастеры для стекла.
- Микробиологическая петля.
- Горелка Бунзена.
- Бактериологический шпатель (стеклянный).
- Большая емкость с дезинфицирующим раствором для сбора жидких отходов.
Таймер.
Контейнеры ("Cinbins" - Мета! Box PLC):
Для загрязненных бактериями наконечников.
Для загрязненных 32Р наконечников.
Для загрязненных 35S наконечников.
Для загрязненных !4С наконечников.
Ткань, не оставляющая волокон (Kleenex tissues) (Kimberley- Clark Ltd.).
- Адсорбирующие бумажные полотенца (Kimberley - Clark Ltd.).
- Benchkote (Whatman).
- Лента Nescofilm (BDH).
- Пленка Saran wrap (Dow Chemical Company Ltd.).
- Наклейки, предупреждающие об электрической, газовой и радиационной
опасности.
- Наклейки Sotch Magic tape (ЗМ United Kingdom PLC.
(UK)).
- Одноразовые резиновые перчатки (например, Surgikos Ltd., Microtouch.).
- Пластиковые одноразовые чашки Петри (Sterilin Ltd.).
