Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
необходимая мера предосторожности. Рассмотрим в качестве примера
трехродительские скрещивания, цель которых - введение рекомбинантных
векторов трансформации pBinl9 в штамм ш'г-помогцник LBA4404. Для селекции
трансконъюгантов агробактерий, несущих предположительно плазмиду
pBinl9CaMV-ca/, можно использовать высев на чашки с NA-fRf+Km. Ни один из
двух штаммов Е. coli не устойчив к Rf, так что только агробактерии могут
образовывать колонии на этих чашках. Для селекции последовательностей
pBinl9 в трансконъюгантах используют ка-намицин.
1.10.2. Обеспечение
Оборудование и приспособления
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1[1]).
- Стерильные зубочистки.
- Термостатируемые качалки с круговым вращением и регуляцией температуры
на 37 и 28 °С с зажимами для универсальных пробирок.
- Термостат на 28 °С.
Бактерии
- Свежие культуры бактерий на чашках:
A. Штамм-помощник (например, HB101/pRK2013).
Б. Реципиентные штаммы агробактерий (например, LBA4404).
B. Колонии с чашек, на которых проводилась селекция трансформантов,
содержащие проверенные рекомбинантные векторы для трансформации растений
(например, pBinl9 CaMV-caf).
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 75
растворы
- Жидкие среды (по 5 мл в стандартных пробирках):
A. NB+селективные антибиотики для штаммов Е. coli (помощника и донора)
(например, 50 мкг/мл Km для НВ101/ /pRK.2013 и 100 мкг/мл Km для
pBinl9CaMV-cotf).
Б. NB+селективные антибиотики для реципиентных штаммов (например, 100
мкг/мл Rf для LBA4404).
B. NB.
- Агаризованные среды (чашки Петри диаметром 9 см, содержащие по 20 мл
среды):
A. NA (для конъюгации).
Б. Чашки для селекции трансконъюгантов с NA (т. е. NA+Rf+; +Km для
селекции трансконъюгантов pBinl9 в LBA4404).
1.10.3. Методика
1. Засевают отдельные колонии донора (т. е. те, которые, согласно данным
рестрикционного анализа, по-видимому, содержат правильные конструкции) и
штамма-помощника Е. coli в 5 мл среды NB, содержащей селективные
антибиотики, и инкубируют на качалке в течение ночи при 37 °С.
2. Засевают отдельные колонии реципиентных штаммов A. tumefaciens в 5 мл
NB+селективные антибиотики и инкубируют на качалке в течение ночи при 28
°С.
3. Переносят с помощью пипетки по 100 мкл каждого из трех скрещиваемых
штаммов (т. е. донора, помощника и реципиента) на одну из чашек с NA и
смешивают путем растирания. Каждое трехродительское скрещивание проводят
дважды и инкубируют в течение ночи при 28 °С.
4. С помощью стерильной петли отбирают по 2 "штриха" с каждой чашки,
ресуспендируют в 500 мкл NB и рассевают штрихом на 2 чашки с NA6>,
содержащие селективные антибиотики как для агробактерий, так и для отбора
введенных рекомбинантных последовательностей.
5. Инкубируют двое суток при 28 °С, в течение которых должны появиться
отдельные колонии агробактерий-трансконъю-гантовв).
Примечания
Кроме того, можно отделить агробактерии от Е. coli на основе их
способности к росту на минимальной среде, но эта селекция требует
осторожности, поскольку Е. coli может расти на небольших количествах
питательных веществ, которые вводятся при небрежном засеве петлей.
Поскольку для введения последовательностей в цис-векторы необходимо
участие не только конъюгации, но и рекомбинации, в этом случае можно
получить приблизительно в 1000 раз меиьшее количество колоний
76
Глава 1
траискоиъюгаитов агробактерий по сравнению с ожидаемым в эквивалентной
бинарной системе.
¦> Агробактерии инкубируют при 28 °С, поскольку Ti-плазмиды не
сохраняются при температуре выше 32 °С.
1.11. Выделение тотальных препаратов нуклеиновых кислот из A.
tumefaciens
1.11.1. Основные положения
После получения трансконъюгантов последовательности вектора необходимо
заново проверить уже в агробактериях, чтобы быть уверенным, что во время
конъюгации не произошли перестройки или делеции. Кроме того, используя
векторы цис-типа, такие, как pGV3850, необходимо продемонстрировать
образование коинтегранта последовательностей промежуточного вектора с
вектором для трансформации растений, определить их взаимную ориентацию и
убедиться, что образование коинтегранта не привело к перестройкам
встраиваемых последовательностей. Неонкогенные трансформирующие Ti-
плазмидные векторы цис-типа - это низкокопийные мегаплазмиды размером
около 180-250 т. п. н. Для характеристики таких больших плазмид,
выделение которых требует специальных методов, необходимо получить
тотальный препарат нуклеиновых кислот с последующим анализом ДНК путем
гибридизации по Саузер-ну, чтобы идентифицировать специфичные
последовательности. Точно так же, чтобы охарактеризовать бинарные
векторы, которые тоже представляют собой низкокопийные плазмиды, при
репликации в агробактериях необходимо выделить суммарные нуклеиновые
кислоты.
Для выделения используют небольшие объемы ночных культур. Методика
включает ферментативную обработку агробактерий с последующим удалением
