Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
осадок на предыдущей стадии.
*> Если для полного заполнения пробирки не хватило градиентного
материала, ее следует заполнить раствором CsCl плотности 1,55 г/мл.
г> Диализные трубки подготавливают к употреблению путем кипячения в 1%-
ном Na2C03 в течение 20 мин. Затем их вымачивают в течение 20 мин в 10 мМ
ЭДТА при комнатной температуре, дважды промывают дистиллированной НгО по
20 мин при комнатной температуре и, наконец, автоклавируют в
дистиллированной Н20.
д> Концентрацию ДНК можио определить либо путем сравнения с известным
стандартом в агарозном геле, либо путем измерения OD260 разведенной
аликвоты раствора плазмиды. OD26o=I>0 соответствует концентрации ДНК 50
мкг/мл.
е) Если плазмиду не удается гидролизовать рестрикционными ферментами, ее
можио дополнительно очистить с помощью экстракции смесью фенол/ хлороформ
между стадиями 19 и 20 следующим образом.
1) Оценивают объем раствора плазмиды, добавляют равный объем сме-сн
фенол/хлороформ (1 -. 1) (см. разд. 1.5.2,1) и перемешивают до
образования эмульсии путем встряхивания.
2) Центрифугируют 5 мии при 8000 об/мии и переносят верхнюю водную
фазу в новую пробирку.
3) Добавляют равный объем хлороформа и сиова встряхивают.
4) Центрифугируют 5 мии при 8000 об/мии и переносят верхнюю водную
фазу в новую пробирку,
5) Осаждают этанолом и растворяют, как иа стадиях 20-24.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 49
1.5. Выделение и очистка рестрикционных фрагментов ДНК для
лигирования
1.5.1. Основные положения
Подробности использования рестрикционных ферментов представлены в
разд. 5.2. Полученные с помощью центрифугирования в градиенте плотности
препараты плазмид обычно отличаются высокой чистотой и легко подвергаются
гидролизу рестрикционными ферментами. Условия лигирования фрагментов ДНК
будут зависеть от стратегии, выбранной для оптимизации выхода требуемых
рекомбинантных молекул. Может возникнуть необходимость отделить
специфичные фрагменты от продуктов рестрикционного гидролиза и/или
дефосфорилировать популяцию фрагментов, чтобы предотвратить
самолигирование; ниже представлены описания этих методик. Перед
составлением с;ие-си для лигирования из растворов ДНК необходимо удалить
рестрикционные ферменты с помощью депротеинизации смесью фенол/хлороформ
и осаждения этанолом. В разд. 1.6 обсуждаются факторы, которые необходимо
учитывать при лигировании фрагментов ДНК с клонирующими векторами.
Например, pBinl9 необходимо разрезать Hindlll и дефосфорилировать, тогда
как pUC18CaMVCAT необходимо разрезать Hindlll, а затем очистить с помощью
электрофореза СаМУ-са/-фрагмент pUC18CaMVCAT размером 4,6 т. п. н. На
рис. 1.10 (дорожки 2"
4 и 5) показаны фрагменты ДНК, обнаруживаемые на различных стадиях
препаративного выделения фрагмента.
1.5.2. Очистка фрагментов ДНК после гидролиза рестриктазами
1.5.2.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
Те же, что и в разд. 5.2.
Растворы
Те же, что и в разд. 5.2, с добавлением следующих:
- Смесь фенол/хлороформ (1:1). Смешивают в соотношении
1 : 1 фенол, насыщенный ТЭ-буфером (ТЭ-буфер, см. разд.
1.4.2), содержащий 0,1% 8-гидроксихинолина, и хлороформ, содержащий 4%
изоамилового спирта. Смесь стабильна при 4°С в течение нескольких
месяцев, ее нельзя использовать, если вместо нормального ярко-желтого
цвета она приобрела (коричневатый оттенок.
- 2 М ацетат натрия, pH 5,6 (разд. 1.4.2).
- 70 %-ный этанол.
- Хлороформ (BDH Analarj.
50
Глава 1
1.5.2.2. Методика
Проводят рестрикцию соответствующей плазмиды, как описано в разд.
5.2.
1. После полного завершения гидролиза доводят объем водой до 100 мкл.
2. Добавляют 100 мкл смеси фенол/хлороформ (1:1) и перемешивают
энергичным встряхиванием.
3. Центрифугируют в микроцентрифуге при 12000 об/мин 5 мин и переносят
верхнюю водную фазу в новую пробирку Эп-пендорф.
4. Добавляют 100 мкл хлороформа, хорошо перемешивают и центрифугируют 1
мин при 12 000 об/мин.
5. С помощью автоматической микропипетки Gilson отбирают нижнюю
органическую фазу и удаляют.
6. Добавляют 10 мкл 2 М ацетата натрия (pH 5,6) и перемешивают.
7. Добавляют 330 мкл этанола и охлаждают на бане сухой лед/этанол в
течение 15 мин.
8. Центрифугируют 15 мин при 12000 об/мин и удаляют супернатант.
9. Добавляют 330 мкл 70%-наго этанола, перемешивают и снова
центрифугируют 5 мин при 12 000 об/мин.
10. Удаляют супернатант, высушивают под вакуумом и ресус-пендируют в
соответствующем объеме Н20 перед использованием в реакции лигирования
(разд. 1.6).
1.5.3. Удаление 5'-фосфатных групп фрагментов ДНК
с помощью фосфатазы из кишечника теленка
1.5.3.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
Растворы
- 10XCIP (500 мМ трис-НС1, pH 8,0; 1 мМ ЭДТА). На 10 мл:
2 М трис-НС1, pH 8,0 (см. разд. 1.4.2) 2,50 мл
0,5 М ЭДТА 0,02 мл
