Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
нанесенные штрихи в стерильном ламинарном боксе в течение 10 мин.
Закрывают крышку, а затем помещают чашку в термостат в перевернутом
положении (крышкой вниз) и инкубируют в тех же условиях температуры и
време-' ни, как указано в разд. 1.3.2.
3. Обматывают края чашки липкой лентой и оставляют при комнатной
температуре, если собираются использовать в течение 2-3 дней, либо хранят
при 4°С в течение месяца.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 41
1.3.4. Длительное хранение бактериальных штаммов
1. Готовят ночную культуру штамма, предназначенного для хранения, как
описано в разд. 1.3.2.
2. Смешивают 0,75 мл ночной культуры с 0,75 мл 40%-ного глицерина в
питательной среде, помещают в холодостойкую пробирку для хранения с
завинчивающейся крышкой емкостью 2 мл, делают соответствующую пометку на
пробирке и быстро охлаждают, опустив в сосуд Дьюара с жидким азотом.
3. Хранят при -80 °С. В этих условиях бактерии остаются жизнеспособными в
течение 10 лет.
4. Для получения быстро растущих клеток из находящихся на хранении
культур захватывают небольшую порцию замороженной смеси с помощью
простерилизованного в пламени
Рис. 1.8. Рассев бактерий на чашках для получения отдельных колоний.
Штрихи наносят в указанном цифрами порядке. Петлю следует пронести через
пламя горелки и охладить между штрихами (1) и (2).
микрошпателя и ресуспендируют в 5 мл NB. Высевают на чашку с
агаризованной бактериальной средой, содержащей селективные антибиотики,
как описано в разд. 1.3.3.
1.3.5. Приготовление чашек для селекции бактерий
Питательный агар необходимо расплавить путем нагревания на пару
(например, в бытовой .кастрюле-скороварке) или с помощью микроволновой
печи и охладить до 45-55 °С (желательно в соответствующей водяной бане),
прежде чем добавить антибиотики или другие термолабильные компоненты.
Чашки можно хранить при 4°С от нескольких дней до нескольких недель в
зависимости от стабильности добавок (подробнее об антибиотиках см.
приложение 1 [II]).
Кроме маркеров устойчивости к антибиотикам для селекции отдельных
хромосомных признаков и поддержания специфических плазмид во многих
современных клонирующих векторах используются комбинации окрашивающихся
индикаторных суб-
42
Глава 1
стратов и индукторов (таких, как X-GAL и ИПТГ) для скрининга
рекомбинантных трансформантов. Например, вектор для трансформации
растений pBin 19 (разд. 1.6) содержит полилинкер ный сайт для встраивания
ДНК в гене lacZ, и любая вставка в этот сайт нарушает продукцию
функционального фермента р-галактозидазы. Поэтому трансформированные
бактериальные колонии, несущие рекомбинантные плазмиды, не способны
расщеплять храмогенные субстраты, такие, как X-GAL, и остаются белыми,
тогда как бактериальные колонии, несущие плазмиды без вставок, имеют
голубую окраску благодаря расщеплению -X-GAL р-галактозидазой.
Таким образом, для скрининга р-галактозидазы добавляют к охлажденному
NA X-GAL и ИПТГ в конечной концентрации 40 мкг/мл. Чашки с X-GAL/ИПТГ
нестабильны и их следует го< товить непосредственно перед использованием.
1.4. Препаративное выделение плазмид из Е. coli в больших объемах
1.4.1. Основные положения
Выделение малых плазмид в больших количествах из Е. coli - это важный
этап любой серии манипуляций, имеющей целью встраивание генов в
трансформирующие векторы растений. Плазмиды могут содержать ген,
предназначенный для переноса, в специфичном рестрикционном фрагменте или
могут быть частью векторной системы трансформации растений, например
промежуточным вектором для коинтеграции с модифицированной плазмидой или
бинарным вектором, способным реплицироваться в Е. coli и агробактериях.
Представленная ниже методика выделения успешно использовалась для
получения различных плазмид (в том числе рBin 19, pBR322, pGV 1103, pUC
18) и представляет собой по существу крупномасштабный вариант
минипрепаративной процедуры, разработанной Бирнбоймом и Доли [10J.
Разделение хромосомной и плазмидной ДНК основано на наблюдении, что
существует узкая область pH 12,0-12,5, в которой линейная хромосомная ДНК
денатурирована, а ковалентно замкнутая кольцевая плаз-мидная ДНК - нет.
Клетки обрабатывают лизоцимом для ослабления клеточной стенки, а затем
лизируют ДСН в присутствии NaOH. Отношение объемов суспензии клеток и
щелочного ДСН имеет важное значение и должно строго соблюдаться,
поскольку определяет конечное значение pH смеси. После нейтрализации
хромосомная ДНК ренатурирует, образуя нерастворимый сгусток, тогда как
плазмидная остается в растворе. Кроме того, высокая концент-
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 43
рация ацетата калия вызывает преципитацию ДСН-белковых комплексов и
высокомолекулярной РНК. Плазмиду осаждают из супернатанта этанолом, а
затем очищают путем центрифугирования в градиенте плотности. Грубый
раствор ДНК смешивают с бромистым этидием (БЭ) и хлористым цезием (CsCl)
