Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
и центрифугируют до установления равновесного градиента плотности CsCl.
БЭ интеркалирует в ДНК и уменьшает ее плавучую плотность. Поскольку
кольцевая ДНК менее способна раскручиваться, чем линейная, в плазмидные
молекулы интеркалирует меньшее количество БЭ, и их плотность,
следовательно, выше,
Хромосомная ДНК ; Плазмидная ДНК. 1
Рис. 1.9. Формирование зон плазмидной и хромосомной ДНК в градиенте
плотности CsCl. В УФ свете сфотографирована центрифужная пробирка, в
которой произошло разделение плазмидной и хромосомной ДНК после
центрифугирования при 55 000 об/мин в течение 22 ч.
чем у линейной хромосомной ДНК. Хотя бактерии содержат кольцевые
хромосомы, они слишком (велики, чтобы выдержать процедуру выделения и
остаться интактными, и, таким образом, в градиенте CsCl плазмидная ДНК
локализуется в зоне, расположенной ниже зоны хромосомной ДНК (рис. 1.9).
С помощью данного метода из 500 мл исходной культуры обычно получают 1-2
мг плазмидной ДНК, свободной от примесей РНК и гидролизуемой
рестрикционными ферментами.
Выделенная плазмидная ДНК представлена тремя формами, в зависимости от
того: 1) являются ли обе цепи полностью ин-
44
Глава 1
тактными и сохранила ли плазмида свою первоначальную супер-
снирализованную, ковалентно замкнутую кольцевую конфигурацию (covalently
closed circle - ссс), 2) получила ли одна из цепей разрыв ("ник"),
позволяющей плазмиде релаксировать и образовать открытое кольцо (open
circle - ос), или 3) цепь ДНК была разорвана с образованием линейной
молекулы (linear- 1). Благодаря различной конфигурации эти три формы
имеют неодинаковую электрофоретическую подвижность в агарозном геле (рис.
1.10, дорожка 3). Точное определение мол. массы возможно только в случае
линейной ДНК, следовательно, для определения размера плазмиды перед
электрофорезом ее необходимо перевести в линейную форму с помощью
подходящей рестриктазы (рис. 1.10, дорожка 2).
1.4.1.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 II]).
- Среднескоростная центрифуга с охлаждением (например, Sor< val RC-5B,
Dupont (UK) Ltd.) с угловыми роторами на 6Х Х250 мл и 8x50 мл.
- Полиалломерные центрифужные стаканы с полипропиленовыми
завинчивающимися крышками на 250 и 35 мл (например, соответствующие
стаканы для высокоскоростных центрифуг Nalgene или LKB).
- Ультрацентрифуга (например, Beckman L7-65 или равноценная) с
высокоскоростным угловым (например, Ti-80) или вертикальным (например,
VTi-65) ротором.
- Полиалломерные центрифужные пробирки и устройство для запаивания
пробирок.
- Силиконированные и автоклавированные центрифужные пробирки из корекса
(Corning Medical).
- Спектрофотометр с УФ-диапазоном не менее чем от 200 до 300 нм
(например, Perkin-Elmer Lambda 5 UVIVIS Spectrophotometer).
- Небольшая пластиковая трубка, один конец которой заткнут 'стекловатой
(Supa Aquatic Supplies Ltd.).
- Диализные трубкиг>.
- Хирургические зажимы (Scientific Industries International Inc. (UK)
Ltd.).
- Одноразовый пластиковый шприц объемам 5 мл, снабженный иглой 0,4x19 см
(Monoject Division).
- Ультрафиолетовая лам-на (например, UV Product, модель UVGL-58),
закрепленная в штативе.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 45
Темная комната.
- Емкость для сбора загрязненного раствора БЭ/CsCl.
- CsCl (BDH, квалификации для градиентного ультрацентрифугирования) .
Растворы
- NB, содержащий соответствующие антибиотики:
5 мл в стандартных пробирках,
500 мл в 2-литровой конической колбе.
- 2М трис-НС1, pH 8,0 и 7,5. На 1 л: растворяют 242,2 г трис-основания в
800 мл дистиллированной НгО и доводят pH концентрированной НС1.
Используют специальный электрод для измерения pH в трис-буферах (Sigma).
Доводят объем до 1 л дистиллированной НгО. Эти растворы стабильны в
течение нескольких месяцев при комнатной температуре.
- Лизирующий раствор (25 мМ трис-НС1, pH 8,0; 10 мМ ЭДТА;
0,5 М глюкоза; 1 мг/мл лизоцима). На 100 мл:
2 М трис-НС1, pH 8,0 1,25 мл
0,5 М ЭДТА 2,00 мл
Глюкоза 9,01 г
Лизоцим (Sigma Grade 1) 0,10 г
Раствор необходимо приготовить без лизоцима, автоклавировать и хранить
при комнатной температуре. Лизоцим добавляют непосредственно перед
употреблением.
- Щелочной ДСН (0,2 М NaOH, 1% ДСН). На 100 мл:
10 М NaOH 2,0 мл
25%-ный ДСН '4,0 мл.
Раствор готовят непосредственно перед употреблением, добавляя компоненты
к 94 мл дистиллированной НгО.
- 3 М ацетат калия, pH 5,2: растворяют 117,78 г ацетата калия (BDH
Analar) в 200 мл дистиллированной воды. Доводят рн до 5,2 ледяной
уксусной кислотой (BDH Analar), объем раствора - до 400 мл, автоклавируют
и хранят при комнатной температуре.
- 2 М ацетат натрия, pH 5,6: растворяют 27,16 г ацетата натрия (BDH
Analar, трехводный) в дистиллированной воде. Доводят pH до 5,6 ледяной
уксусной кислотой (BDH Analar), объем раствора - до 100 мл, автоклавируют
