Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
инженерных методов для конститутивного синтеза в растительных клетках
(табл. 2.1). В некоторых экспериментах в качестве доминантных маркеров
успешно использовались ферменты, обеспечивающие защиту от гербицидов.
Обычно добиваются слияния кодирующей последовательности фермента с
промоторами, выделенными из Т-ДНК или генома вируса мозаики цветной
капусты (ВМДК), на 5'-конце, а на З'-конце - с сигналом
полиаденилирования (тоже полученным, как правило, из какого-либо гена Т-
ДНК). В качестве маркерных генов наиболее широко используют гены
устойчивости к таким антибиотикам, как канамицин, G418 [8, 27],
гигромицин [54] и блеомицин [28] Недавно для трансформации растительных
клеток в качестве доминантных маркеров были использованы гены,
обеспечивающие устойчивость к гербицидам, таким, как глифосат [45].
Поскольку селективные маркерные гены нормально функционируют в
трансформированных
34
Глава 1
растительных клетках и не влияют на манипуляции с рекомбинантными ДНК,
более подробно использование таких маркерных генов обсуждается в гл. 2.
Удобство того или иного селектирующего агента зависит от его способности
создать селективное давление на используемые растительные ткани. Было
показано, что устойчивость к канамицину представляет собой очень удобный
маркер трансформации, и поэтому во всех описываемых в дальнейшем
экспериментах по трансформации и манипуляциях с рекомбинантными ДНК
использованы векторы, несущие ген Ктг-
Маркерные гены для скрининга
Маркерные гены для скрининга (табл. 2.1) входят в состав многих
трансформирующих векторов по двум причинам. Во-первых, чтобы обеспечить
независимое подтверждение трансформированного статуса тканей, растущих на
среде, содержащей селектирующие антибиотики или гербициды. Во-вторых, в
качестве основного средства идентификации трансформантов в условиях,
когда частоты трансформации высоки, а трансформированные ткани, в
основном, имеют клональное происхождение; примером могут служить
трансформированные побеги и корни, а также колонии, полученные из
протопластов, высеянных на чашку в условиях низкой плотности (последние
обычно можно рассматривать, как возникшие из отдельных трансформированных
клеток).
В случае скринируемых маркеров важным фактором является простота,
стоимость и специфичность методов обнаружения. Доступные в настоящее
время методы анализа наиболее часто используемых скринируемых маркеров
(хлорамфениколацетил-трансферазы, октопин- и нопалинсинтазы, p-
глюкуронидазы, р-галактозидазы и люциферазы) подробно обсуждаются в гл. 2
(табл. 2.1). В векторных системах на основе Ri-плазмид дикого типа в
качестве маркера опухолевой трансформации клеток обычно используют
продукцию агропина или маннопина.
1.1.10.4. Сайты для клонирования в векторах трансформации растений
В данной главе предполагается, что цель эксперимента заключается
просто во встраивании гена, клонированного ранее в Е. coli, в обычный
вектор для трансформации растений; затем он должен быть перенесен с
помощью конъюгации в агробактерии. В результате получают штамм, готовый
для трансформации. Обычные методы рекомбинантных ДНК, бактериальной
трансформации и конъюгации, выделения и анализа плазмид, как
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 35
правило, можно использовать для всех типов трансформирующих векторов
растений.
Во многих трансформирующих векторах присутствуют только один или два
удобных рестрикционных сайта для клонирования, тогда как другие более
универсальны и содержат ряд удобных сайтов в полилинкере, иногда
расположенном в области а-комплементации р-галактозидазы, что позволяет
обнаружить трансформированные рекомбинантные бактериальные клоны на
чашках с X-GAL/ИПТГ (табл. 1.1 и 1.2).
1.1.11. Клонирование в векторах для трансформации растений
Основные методы рекомбинантных ДНК, необходимые для инсерции генов в
трансформирующие векторы растений, не отличаются от таковых, используемых
в работе с малыми плазмидами любого другого типа, реплицирующимися в Е.
coli. Рестрикционный фрагмент ДНК, несущий нужный ген, с помощью
лигирования встраивают либо в промежуточный вектор (используемый для
образования коинтегранта с Ti-плазмидным вектором цис-типа), либо в
бинарный вектор, а затем трансформируют подходящий хозяйский штамм Е.
coli с помощью стандартных методик.
Цель данной главы заключается в том, чтобы дать некоторые простейшие
указания, как осуществить инсерцию рестрикционного фрагмента ДНК в вектор
для трансформации растений, и посвятить исследователя в основы технологии
рекомбинантных ДНК- За более детальным разъяснением принципов
клонирования генов и анализа последовательностей ДНК следует обратиться к
литературным источникам, например [11, 39].
Для удобства описания методов рекомбинантных ДНК в этом разделе в
качестве примера мы будем использовать бинарный вектор pBin 19 (разд.
1.1.7.2 и рис. 1.5) [8]. Как пример коин-тегративного вектора, мы будем
