Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
(приложение 1 [I]).
- Оборудование для электрофореза в агарозном геле (разд.
5.3.2).
- УФ-траисиллюминатор (например, UV Products Ltd., модель TS-36).
- Защитные очки и маска для работы с ультрафиолетом.
- Пинцет с тупыми концами. -
- Кусочки фильтра Millipore GVWP04700 или Genescreen (BRL (UK) Ltd.)
размером 2,5x2,5 ом.
- Пластиковые палочки для перемешивания (W. Sarstedt & Co.). Растворы
- Растворы для электрофореза в агарозном геле (разд. 5.3).
- Буфер для элюции (50 мМ трис-НС1, pH 7,5; 0,1% ДСН).
На 100 мл:
2 М трис-НС1, pH 7,5 (разд. 1.4.2) 2,5 мл
25%-ДСН 0,4 мл
Готовят путем добавления компонентов к 97,9 мл НгО.
- Фенол/хлороформ (1 :1) (разд. 1.5.2.1).
- 5 М NaCl.
- 70%-ный этанол.
- Стерильная дистиллированная НгО.
Г.5.5.2. Методика (модифицирована по [62])
1. Вырезают рестрикционный фрагмент из 0,8%-ного агарозного геля >в как
можно меньшем объеме (см. разд. 1.5.4.2).
2. Собирают фильтрующее устройство следующим образом:
а) осторожно отрезают нижнюю коническую часть пробирки Эппендорф
на 1,5 мл и протыкают отверстие в дне с по-помощью тонкой иглы от шприца;
54
Глава 1
б) смачивают буфером для'элюции 2,5-сантиметровый квадратный кусочек
фильтра Millipore GVWP04700 или Ge-nescreen, складывают вчетверо и с
помощью тонкой закругленной на конце палочки, стараясь не разорвать
фильтр, проталкивают его в конический держатель фильтра.
3. Помещают фрагмент геля в фильтрующее устройство, затем - в пробирку
Эппендорф на 1,5 мл без крышки и центрифугируют 10 мин при 12 000 об/мин,
а затем удаляют устройство для фильтрования, содержащее агарозу.
4. Добавляют к фильтрату 100 мкл омеси фенол/хлороформ,
депротеинизируют путем сильного встряхивания и центрифугируют 5 мин при
12000 об/мин.
5. Переносят верхнюю водную фазу в новую пробирку.
6. Повторяют стадии 4 и 5.
7. Добавляют 100 мкл хлороформа, перемешивают и центрифугируют 1 мин
при 12 000 об/мин.
8. С помощью микропипетки Gilson отбирают и удаляют нижнюю
органическую фазу.
9. Оценивают объем раствора ДНК и добавляют 0,25 объема
5 MNaCl.
10. Добавляют 3 объема этанола и охлаждают в бане сухой лед/этанол в
течение 15 мин.
11. Центрифугируют 15 мин при 12 000 об/мин и сливают супернатант.
12.-Добавляют 500 мкл 70%-ного этанола, снова центрифугируют 5 мин при
12000 об/мин и сливают супернатант.
13. Осадок высушивают под вакуумом, а затем ресуспендируют в
соответствующем объеме НгО для добавления в реакцию лигирования (разд.
1.6).
1.6. Лигирование фрагментов ДНК с векторами для трансформации растений
1.6.1. Основные положения
Лигирование представляет собой энергетически зависимую реакцию, в
которой происходит ковалентное соединение фрагментов двуцепочечной ДНК,
имеющей тупые "ли липкие концы (т. е. 5'- или З'-выступающие концы).
Фосфатные группы на 5'-концах конденсируются с близко расположенными З'-
гидро-ксильными группами, образуя непрерывный сахаро-фосфатный остов.
При рассмотрении вероятных форм продуктов лигирования важное значение
имеют два фактора, i и /.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 55
{- это общая концентрация самокомплементарных концов в реакции; она
служит мерой вероятности взаимодействия одного из концов с другим
комплементарным концом другой молекулы.
Если у фрагмента одинаковые комплементарные концы, то
i = 2N0MX10"3 = 1,2Х Ю21М концов/мл.
Если у фрагмента различные, некомплементарные концы, то для каждого
типа концов
i = NoMxl0"3 = 6,0Xl02°M концов/мл,
где No - число Авогадро, а М - молярная концентрация молекул ДНК.
j - это эффективная концентрация одного конца вблизи другого конца
той же молекулы; она представляет собой меру вероятности, с которой
каждый конец может взаимодействовать с другим комплементарным концом той
же самой молекулы. Величина / определяется на основании допущения, что
ДНК существует в форме стохастического клубка
. . Г 3 12/3 rMWA.13/2 6,2ХЮг2 ,
/ = ---- = /А ----- = -------концов/мл,
L2nib J L MW (MW)3/2
где I - 'контурная длина, b - длина сегмента стохастического клубка и MW
- мол. масса молекулы ДНК, а /Я и MWX - это соответствующие величины для
бактериофага Я.
При рассмотрении популяции фрагментов ДНК одинаковой длины, каждый из
которых имеет по два комплементарных конца, форму продуктов лигирования
можно предсказать на основании соотношения j:i. При отношении j:i=\
образуются равные количества кольцевых мономеров и линейных димеров;
j:i>l сдвигает равновесие в сторону преимущественного образования
кольцевых мономеров, a /:i< 1 - преимущественного образования линейных
конкатемеров. Преобразовав написанноё выше равенство, получим формулу для
вычисления концентрации ДНК в моль/л (М), необходимую для достижения
