Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 23

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 17 18 19 20 21 22 < 23 > 24 25 26 27 28 29 .. 184 >> Следующая

и хранят при комнатной температуре.
- ТЭ-буфер (10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5). На 100 мл: 2 М трис-НС1,
pH 7,5 0,5 мл
0,5 М ЭДТА 0,2 мл.
Доводят до нужного объема дистиллированной НгО, автоклавируют и хранят
при комнатной температуре.
- 10 мМ трис-НС1, pH 7,5 (готовят из 2 М трис-НС1, pH 7,5, см. выше).
46
Глава 1
- Бромистый этидий (Sigma) (5 мг/мл в дистиллированной воде); хранят
при 4°С в темноте. Этот раствор стабилен в течение нескольких месяцев.
- CsCl, насыщенный изопропанолом: перед употреблением заливают
насыщенный раствор CsCl изопропанолом, энергично встряхивают до
образования эмульсии, а затем дают фазам разделиться.
- Изопропанол (BDHAnalar).
- Диэтиловый эфир (BDH Analar).
I.4.1.2. Методика (модифицирована по [10])
1. Засевают отдельную колонию нужного штамма Е. coli в 5 мл NB,
содержащего селективные антибиотики, и инкубируют при 37 °С с аэрацией в
течение ночи.
2. Инокулируют 50 мкл этой суспензии в 500 мл NB, содержащего
селективные антибиотики, в 2-литровой колбе и инкубируют на качалке при
37 °С в течение ночи.
3. Собирают клетки центрифугированием в двух стаканах по 250 мл при
8000 об/мин и 4 "С в течение 5 мин, используя центрифугу Sorval RC-5B
(или аналогичную).
4. Удаляют супернатант и тщательно ресуспендируют осадок в двух порциях
по 20 мл лизирующего раствора, объединяют и инкубируют на льду в течение
5 мин.
5. Добавляют 80 мл щелочного ДСН, перемешивают и инкубируют 4 мин на
льду.
6. Добавляют 60 мл 3 М ацетата калия (pH 5,2) и хорошо перемешивают.
7. Центрифугируют 10 мин при 8000 об/мин и 4°С и переносят супернатант
в чистый центрифужный стакан на 250 мл, предварительно отфильтровав через
пластиковую воронку со стекловатой.
8. Добавляют 100 мл изопропанола, хорошо перемешивают и центрифугируют
10 мин при 8000 об/мин и 4°С.
9. Осторожно промывают осадок 70%-ным этанолом, а затем эфиром и
выпаривают эфир в вытяжном шкафуа>.
10. Растворяют осадок в 10 мл ТЭ-буфера.
II. С помощью весов доводят объем до 17,5 г (если требуется,
добавляют ТЭ-буфер), добавляют 20,79 г CsCl и 3,5 мл раствора БЭ.
Конечная плотность раствора должна составлять примерно 1,55 г/мл.
12. Центрифугируют 15 мин при 15000 об/мин и комнатной температуре в
центрифужных пробирках емкостью 35 >млб).
13. Полностью заполняют пробирки для ротора Ti80 Beckman (или
равноценного) подготовленным раствором ДНКВ) и запаивают отверстия
пробирок.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 47
14. Центрифугируют 22 ч при 55000 об/мин и 15°С.
15. Осторожно вынимают пробирки из ротора и осматривают их в темной
комнате под УФ-светом. На этой стадии должны быть видны две зоны -
верхняя, четкая зона хромосомной ДНК и нижняя, более диффузная зона
плазмидной ДНК
t 2 3 4 5.
Рис. 1.10. Препаративное выделение фрагмента ДНК для лигирования. 1.
Маркеры мол. массы (смесь фрагментов ДНК фага X, расщепленной Hindlll и
Hindlll-\-Eco'S.l). 2. pBin!9, переведенная в линейную форму с помощью
Hindlll. 3. Неразрезанная ДНК pBin 19 после очистки в градиенте плотности
[ссс, л, ос и мм (мультимерные) формы плазмидной ДНК]. 4. pUC18CaMVCAT
после расщепления' Hindlll: фрагменты длиной 4,6 и 2,7 т. п. н. 5. СаМV-
cat-фрагмеит длиной 4,6 т. п. и. после выделения из агарозы с помощью
электро-
элюции.
(рис. 1.10). Прокалывают верхнюю часть пробирки и, используя шприц и
иглу, введенную через боковую стенку пробирки чуть ни же нижней зоны,
собирают нижнюю зону в как можно меньшем объеме, и переносят содержимое в
стерильную стандартную пробирку.
ч
Глава 1
16. Удаляют'полностью БЭ путем многократной экстракции нижней (водной)
фазы равным объемом изопропанола, насыщенного CsCl и Н20.
17. Переносят раствор плазмиды в приготовленный диализный 1мешокг), один
конец которого пережат хирургическим зажимом, и пережимают другой конец
аналогичным образом.
18. Диализуют против 2 л НгО в течение 3 ч при 4°С на магнитной мешалке,
меняя НгО через каждый час.
19. Переносят раствор плазмиды в подходящую емкость (например,
силиконированную пробирку из корекса) и определяют концентрацию
плазмидыд). Если концентрация ниже требуемой, необходимо переосадить
плазмиду этанолом, как описано на стадиях 20-24.
20. Добавляют 0,1 объема 2 М ацетата натрия (pH 5,6) и пере--мешивают.
21. Добавляют 3 объема этанола, перемешивают и охлаждают в течение 15 мин
в бане сухой лед/этанол.
22. Центрифугируют при 10 000 об/мин и комнатной температуре 15 мин.
23. Удаляют супернатант, промывают осадок 70%-ным этанолоя и высушивают в
вакууме.
24. Ресуспендируют в небольшом объеме 10 мМ трис-НС1 (pH 7,5е)), измеряют
концентрацию я) и доводят до 0,5 мг/мл.
Примечания
*) Эфир можно быстро удалить током N2 с помощью пастеровской пипетки,
соединенной гибким шлангом с каким-либо сосудом, подающим азот.
6> С помощью этого приема удаляется вся РНК и белок, которые выпали в
Предыдущая << 1 .. 17 18 19 20 21 22 < 23 > 24 25 26 27 28 29 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed