Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
несущих плазмиды со вставкой (для этого можно применить различные методы,
такие, как инактивация доминантного маркера, экспрессия новых
фенотипических свойств или гибридизация ДНК из лизированных бактериальных
колоний с радиоактивными пробами), и затем выделение клонированной ДНК
путем получения "мини-препаратов" плазмид (разд. 1.8) с последующим
гидролизом рестрикционными ферментами и анализом в агарозном геле (разд.
5.3).
Лигирование по тупым концам менее эффективно, чем лигирование липких
концов, и проводится в других условиях инкубации. Ниже описана методика
постановки реакции для липких концов на примере вектора pBinl9 и Я/пеШ1-
фрагмента CaMV-cat в качестве вставки. Кроме того, приведена и методика
лигирования по тупым концам.
1.6.2. Обеспечение
Оборудование и приспособления
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Водяная баня на 4°С (для лигирования "по липким концам") или на 22°С
(для лигирования "по тупым концам").
Растворы
- Растворы плазмидных ДНК: например, плазмида pBinl9 (125 нг/мкл) и
дефосфорилированная pBinl9, расщепленная Hindlll (125 нг/мкл), Яг'шШ1-
фрагмент CaNW-cat (60 нг/мкл).
- Десятикратный буфер для лигирования [660 мМ трис-НС1, pH 7,6; 50 мМ
MgCb, 50 мМ дитиотреитол (ДТТ), 10 мМ АТР]. На 1 мл:
2 М трис-НС1, pH 7,6 330,0 мкл
MgCl2 (Sigma, шестиводный) 10,2 мг
1 М ДТТ (Sigma) 50,0 мкл
ATP (Pharmacia, двунатриевая соль) 6,1 мг Дистиллированная Н20
до 1,0 мл
Приготовленный раствор следует разделить на аликвоты, хранить при -20 °С,
оттаивать во льду непосредственно перед употреблением и использовать
только однократно.
- 100 мМ спермидин. На 1 мл:
Спермидин (Sigma, тригидрохлорид) 25,5 мг Дистиллированная Н20
до 1,0 мл
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 59
Таблица 1.4. Контрольные пробы, постановка которых осуществляется
параллельно реакции лигирования, где в качестве вектора используют pBin
19, а ЯтйШ-фрагмент СаМV-cat - в качестве вставки
Добавляемый объем (мкл) Номер пробир <и
1 2 3 4 5 б
Нерасщеилениый вектор 10 10 _. _ _. _
Расщепленный вектор --- ---. 10 10 --- ---
Расщепленный и дефосфорилироваи- 10 5
иый вектор . • - - _ 5
Расщепленная вставка
Десятикратный буфер для лигирова --- 2 2 2 2 2
ния _. 1 1 1 1 1
100 мМ спермидин
20 мМ АТР -. 1 1 1 1 1
Дистиллированная Н20 10 5 6 5 5 5
Т4-ДНК-лнгаза --- 1 ---. 1 1 1
Полный объем (мкл) 20 20 20 20 20 20
- 20 мМ АТР. На 1 мл:
ATP (Pharmacia, двунатриевая соль) 12,2 мг
Дистиллированная Н20 до 1,0 мл
- Т4-ДНК-лигаза (New England Biolabs, 400 000 ед/мл), разведенная до
0,1ед./мл (для лигирования "по липким концам") или 1,0 ед./мл (для
лигирования "по тупым концам") буфером для хранения, .рекомендованным
поставщиком фермента.
1.6.3. Методика (модифицирована по [39])
Представленная ниже методика широко используется для вставки
рестрикционных фрагментов ДНК в малые клонирующие векторы. Однако, помимо
концентраций ДНК вектора и вставки, участвующих в реакции лигирования, на
эффективность лигирования и последующих этапов трансформации, следующих
за инкубированием лигируемой смеси с компетентными клетками Е. coli
(разд. 1.7), могут влиять многие факторы. Таким образом, обычно проводят
серию контрольных реакций для выявления возможных причин неудачного
эксперимента. В табл. 1.4 представлены контрол-и, которые следует
поставить в описанной ниже реакции лигирования. В табл. 1.5 приведены
типичные результаты, отражающие число трансформантов, полученных при
трансформации штамма JM83 Е. coli этими лигированными смесями.
Пояснение. Результат лигирования обычно известен только после
трансформации компетентных клеток. Цель постановки указанных контролей
состоит в том, чтобы удостовериться, что все этапы, предшествующие
трансформации, и сама трансформация
60
Глава 1
Таблица 1.5. Результаты типичного эксперимента по лигированию и
трансформации
Номер про Селективная среда Разведение Число колоний
бирки
1 NA io-e 185
NA+Km io-2 698
NA+Km 10-" 73
2 NA+Km 10-* 659
NA+Km 10-" 59
3 NA+Km 10" 52
