Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
расплавленной легкоплавкой агарозой и дают ей застыть.
Анализ организации и экспрессии генов растений
355
7. Готовят раствор для заливки геля. Если поверхность геля равна А см2,
то смесь следующих компонентов дает верхний слой толщиной 0,15 см:
Смешивают агарозу, охлажденную до 37 °С, с NRB (также при 37 °С) и
добавляют канамицин. До заливки выдерживают при 37 °С. В конце добавляют
32Р-АТР, тщательно перемешивают и выливают на поверхность геля.
8. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
9. Помещают на гель лист бумаги Whatman Р81 (надписывают карандашом и
отмечают ориентацию), а сверху кладут пачку из 12 листов фильтровальной
бумаги Whatman 3 ММ (вырезанных по размеру геля). Если бумажная лента,
которой обклеена пластинка, мешает, следует обрезать скальпелем ее углы и
распрямить. Сверху помещают груз весом 1 кг и оставляют для переноса на
1-3 чв).
10. Снимают бумагу Р81, удаляют налипшую агарозу и затем инкубируют
бумагу в течение 30 мин в растворе протеиназы при 60 °СГ).
11. Промывают в течение 5 мин горячим (80-90 °С) фосфатным буфером (10
мМ, pH 7,6). Повторяют 5 раз.
12. Высушивают бумагу под сушильной лампой или горячим воздухом,
накрывают пленкой и помещают да экспозицию с рентгеновской пленкой на
период от 1 ч до 1 нед в зависимости от интенсивности сигнала.
13. В качестве примера рассмотрим определение активности NPT-II в тканях
моркови, трансформированной nos-npt-II, и тканях табака,
трансформированных МС-npt-II. В тканях моркови, трансформированных nos-
npt-II, выявляется небольшое количество NРТ-II, которая обычно обладает
той же подвижностью, что и нормальный бактериальный фермент (рис. 6.15,
фильтр А, дорожки 3, 4 и 1 соответственно). В тех же образцах
присутствуют и другие фосфорилазы, которые в результате реакции
обусловливают появление радиоактивных белков. Некоторые из этих белков
обладают сильным сродством к бумаге Р81 и связываются с ней, что дает на
радиоавтографе неспецифические пятна. Такие пятна до отмывания можно
удалить с бумаги Р81, обработав ее протеиназой (стадия 10), после чего
выявляется лишь фос-форилирующая активность, обусловленная NPT-II (рис.
6.15, фильтр Б).
(Ч-32Р) АТР Канамицин сульфат NRB
Агароза LGT
0,5 АмкКи 0,2 Амкл 0,075А мл 0.075А мл
356
Глава 6
Активность NPT-II в тотальных экстрактах листьев растений SR1,
трансформированных MC-npMI, очевидно, связана с двумя электрофоретически
различающимися полипептидами (рис. 6.15, фильтр В, дорожка 1). Верхняя
зона, вероятно, представляет собой цитоплазматическую tp-NPT-II
(транзитный пептид с мол. массой 500-6000 плюс молекула фермента с мол.
H#
Ш:
1 2 3
tp-NPT
dL
тг
Рве. 6.15. Определение активности NPT-II in situ. Фильтр А: дорожка 1 -
неочищенный экстракт из штамма Е. coli, экспрессирующего ген npt-II-, 2 -
экстракт из контрольного ^трансформированного каллуса моркови; 3 и 4 -
экстракты из суспензии проэмбриогенных клеток моркови, полученных из
каллуса, трансформированного штаммом С58С1 (pGV3850:: 1103) A.
tumefaciens. Фильтр Б: удаление загрязняющих продуктов фосфокиназной
реакции при обработке протеиназой. Дорожка 1-необработанные, 2 -
обработанные про-теиназой. Фильтр В: использование гена npt-II в качестве
индикаторного для выявления роли транзитного пептида при переносе
продукта гена МС РБФК/О в хлоропласт и его компартментализацию. Дорожка
1-экстракт тотального белка из растений табака МС РБФК/0-npt-II', 2-
экстракт из хлоропластов МС РБФК/О-npt-II, обработанных трипсином; 3 -
аналогичным образом обработанные хлоропласты nos-npt-II.
массой 25 000), а нижняя зона представляет собой NPT-II, локализованную в
хлоропластах и обладающую нормальной мол. массой (25 000). В пользу этого
предположения говорит тот факт, что в хлоропластах растений выявляется
лишь одно пятно, соответствующее активности NРТ-II, и его подвижность
соответствует нижнему из двух пятен. (Сравните дорожки 1 и 2 на рис.
6.15, В.) Отсутствие верхней зоны в препаратах хлоро-
Анализ организации и экспрессии генов растений
357
пластов показывает, что в результате переноса полипептида tp-NPT-II в
хлоропласта происходит удаление транзитного пептида. Этот факт тоже
свидетельствует о том, что препарат хло-ропластов содержит мало
цитоплазматической NPT-II либо вообще не загрязнен ею.
Кроме того, результаты эксперимента показывают, что транзитный пептид
избирательно направляет NPT-II в хлоропла-сты, поскольку препараты
хлоропластов из растений МC-npt-II (рис. 6.15, фильтр В, дорожка 2)
содержат гораздо более высокие уровни NPT-II, чем препараты из растений
nos-npt-II (рис. 6.15, фильтр В, дорожка 3).
Примечания
а> Выход тотального белка из каллуса табака составляет ориентировочно 20-
30 мкг/100 мг ткани, а 5-10 мкг обычно достаточно для получения хорошего
