Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 162

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 156 157 158 159 160 161 < 162 > 163 164 165 166 167 168 .. 184 >> Следующая

ронидаза легко и без значительных материальных затрат определяется с
удовлетворительной чувствительностью in vitro и in situ в гелях и
достаточно устойчива, чтобы выдержать фиксацию, что позволяет
гистохимически выявлять ее локализацию в клетках и на срезах тканей.
6.9.2. Слияние с геном GUS
Система слияния с геном GUS предназначена для конструирования
химерных p-глюкуронидазных генов и чувствительного анализа их продуктов.
У большинства высших растений, включая табак, петунию, картофель, томат,
Brassica sp., сою, пшеницу, ячмень и Arabidopsis, эндогенная (J-
глюкуронидазная активность низка либо полностью отсутствует [27].
Молекула фермента сохраняет активность в случае присоединения больших
пептидов к N-концу, что позволяет конструировать системы слитых генов.
Таким образом, этот фермент пригоден для изучения транзитных или
сигнальных пептидов, ответственных за перенос как в трансгенных системах,
так и in vitro.
6.9.2.1. Система слияния генов рВ1 101 GUS
Плазмида рВ1 101.1 [27] (рис. 6.17,Л) представляет собой кассету CUS,
лишенную промотора и встроенную в бинарный плазмидный вектор pBinl9
агробактерий [3] (гл. 1). Этот вектор состоит из гена GUS плазмиды
p>RAJ260 (функционально идентичной плазмиде pRAJ255 [26]), соединенного
по тупым коццам с заполненным сайтом Asp7\8(Kpnl) полилинкера pBin 10
(тот же, что и полилинкер pUC19). Он расположен за 260 п.н. до фрагмента
Ss^I = ?coRI, содержащего сигнал поли-аденилирования гена нопалинсинтазы
Ti-плазмиды pTiT37 A. tumefaciens [4]. Это позволяет легко встраивать
промоторы перед GUS, используя полилинкер (гл. 1), и переносить
конструкции в растения, используя преимущества системы бинарных векторов.
Вектор рВI 101.1 содержит сайт инициации репликации низкокопийной
плазмиды RK2 и придает устойчивость к канамицину как бактериям, так и
растениям. Следует предостеречь, что в связи с отсутствием "ложных"
кодонов ATG во фрагменте вектора, содержащем ген GUS, для всех
промоторов, клонированных в ЯшйШ-сайте, могут возникать сложности,
Анализ организации и экспрессии генов растений
365
щжжщ
рВ1131
PBI 121
рВ1101
тоа. *
Кодирующая последовательность гена npt-11 j. | Кодирующая
последовательность гена р глчжуронидазы
[}jf[|j)||]| Промотор гена nos
''А Промотор гена МС РБФК/О
Сигнал полиэденилирования гена nos | | ПромоторBMUK-35S
Р Повтор длиной 25 д. и.
Б
рВ1 101.1:
рВ1 101.2:
рВ1 101.3:
AAG СТТ GCA TGC CTG CAG GTC GAC ТСТ AGA GGA ТСС CCG GGT GGT CAG ТСС СТТ
ATG ТТА...
A AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT СТА GAG GAT CCC CGG GTA ТСС CTT ATG
TTA...
AA GCT TGC ATG CCT GCA GGT CGA CTC TAG AGG АТС CCC GGG TAC GGT CAG TCC
CTT ATG TTA...
Рис. 6.17. Система слияния на основе гена GUS: А - строение
основного вектора
рВ1 101 для слияния с геном GUS. Приведен пример его использования
с двумя промоторными последовательностями растений. Б - нуклеотидная
последовательность области слияния в полилинкере векторов,
предназначенных для слияния с геном GUS. Инициаторные кодоны GUS выделены
жирным шрифтом. Рестрикционные сайты Bam HI подчеркнуты.
366
Глава b
обусловленные наличием ATG в сайте Sphl полилинкера GCATGC.
Серия рВ1 101 содержит три плазмиды, специально сконструированные для
слияния генов и позволяющие получать участки соединения во всех трех
рамках считывания. Векторы рВ1 101.2 и рВI 101.3 представляют собой
плазмиды, полученные из рВ1 101.1. Эти плазмиды обеспечивают встраивание
в двух других рамках считывания GUS относительно сайта полилинкера (рис.
6.175).
Олигонуклеотид S'-GATTTCACGGGTTGGGGTTTCT-S' весьма удобен для
определения последовательностей нуклеотидов в областях соединения гена
GUS методом затравочного синтеза-Данный олигонуклеотид, содержащий 22
нуклеотида, комплементарен участку кодирующей цепи гена GUS, который
оканчивается через 14 п. н. после А инициаторного кодона ATG. При слиянии
генов эту затравку можно успешно применять для определения нуклеотидной
последовательности обеих цепей в мини-препаратах ДНК. Такой
олигонуклеотид можно использовать и для анализа химерных транскриптов
методом затравочного синтеза [6].
6.9.3. Определение активности GUS в экстрактах растений
Для количественного определения и локализации GUS разработаны самые
разнообразные подходы, включая спектрофо-тометрию, флуориметрию,
идентификацию in situ в геле и гистохимические методы. В данном разделе
описаны методы, которые могут оказаться полезными при постановке
различных экспериментов.
6.9.4. Выделение GUS из тканей растений
Для определения активности GUS в тканях или культурах проводят
гомогенизацию в самых различных буферах, однако наиболее успешно
используют буфер, в состав которого входит 50 мМ NaP04, pH 7,0; 10 мМ
ЭДТА; 0,1%-ный тритон Х-100; 0,1%-ный саркозил; 10 мМ р-МЭ. Клетки можно
разрушить с помощью френч-пресса, а также озвучивая или растирая их с
Предыдущая << 1 .. 156 157 158 159 160 161 < 162 > 163 164 165 166 167 168 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed