Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
разделить белки можно и в растворе с помощью зонального электрофореза,
обычно принято использовать несущую среду. Большим преимуществом твердой
фазы служит то обстоятельство, что после окончания электрофореза
разделенные белки остаются на месте. Метод электрофореза в
полиакриламидном геле весьма популярен для разделения сложных смесей
белков и обладает многими преимуществами по сравнению с другими
способами. Пористая природа геля обусловливает активное участие матрикса
в разделении, и, таким образом, можно разделять молекулы с одинаковым
зарядом разного размера. Кроме того, можно легко изменять размер пор в
широком диапазоне значений так, чтобы он соответствовал различным задачам
разделения. Если белки наносят в виде образцов большого объема, то обычно
используют ступенчатые буферные системы, чтобы не ухудшалось разрешение.
В такой системе образцы наносят в лунки в крупнопористом
"концентрирующем" геле, заполимеризованном поверх мелкопористого
"разделяющего" геля. Белки в разведенном образце быстро проходят через
концентрирующий гель, но скапливаются на границе двух гелей и образуют
узкую зону. Таким образом, все белки начинают перемещаться в разделящем
геле с одной и той же позиции. Для определения массы обычно используют
денатурирующий полиакриламидный гель, т. е. белки диссоциируют в
восстанавливающих условиях на составляющие их полипептиды с помощью
детергентов, например ДСН. Этот детергент связывается с молекулами белков
и выравнивает различия в зарядах; таким образом, разделение белков
происходит только по размеру. Очевидно, что денатурирующие условия не
подходят для анализа большинства ферментов, поскольку для сохранения
каталитической активности необходимо поддерживать белок в нативном
состоянии. В этих случаях используют электрофорез в геле при
неденатурирующих условиях, когда разделение определяется как зарядом, так
и размером молекул. При этом трудно сопоставлять размеры белков, даже
если они перемещаются рядом. Полиакриламид химически инертен и, что
особенно важно для определения NPT-II in situ, достаточно прочен, чтобы
выдержать необходимые промывания и смены буфера.
Для удобства сперва заливают разделяющий и концентрирующий гели, и,
таким образом, пока они полимеризуются и охлаждаются до 4 °С, можно
провести экстракцию тканей.
Анализ организации и экспрессии генов растений
349
6.7.2.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Прибор для вертикального электрофореза в пластинах (например, Hoefer
Scientific Instruments).
- Источник питания (2000 В, например, LKB 2197).
- 1%-ная агароза с высокой температурой плавления (напри-
мер, Miles Scientific; SeaKem HGT) в дистиллированной Н20.
- Кипящая водяная баня.
- Вакуумный насос.
Растворы
- Пятикратный буфер для электрофореза (трис-глицин, pH 8,3).
На 1 литр:
Глицин 139,6 г Трис-ОН 15,2 г
Раствор без доведения должен иметь требуемый pH.
- Раствор акриламид/бисакриламид (30:0,8%). На 1 литр:
Акриламид(ВОН) 30,0 г
Бисакриламид(ВОН) 0,8 г
Следует использовать реактивы фирмы BDH степени очистки Electran
(специально очищенные для электрофореза) либо эквивалентной. Растворяют в
дистиллированной НгО и деионизуют перед использованием, перемешивая в
течение 1 ч с 5 г анион-катионной смолы (Амберлит MG-1, BDH) на 100 мл
раствора. Раствор фильтруют через Whatman № 1 в темную стеклянную посуду
и хранят в темноте при 4°С.
- 1 М трис-НС1, pH 8,8 и 6,8. На 1 литр-, растворяют 121,1 г трис-ОН в
800 мл дистиллированной Н20 и доводят до нужного pH концентрированной
НС1. При доведении следует использовать специальный электрод для
определения pH растворов, содержащих трис (Sigma). Доводят объем до 1 л
дистиллированной Н20. Эти растворы при комнатной температуре стабильны в
течение нескольких месяцев.
- ТЕМЕД (Sigma): хранят в темноте при 4°С. Используют только недавно
вскрытые флаконы.
- 1,5%-ный раствор персульфата аммония. На 10 мл: растворяют 150 мг
вещества степени очистки Electran (BDH) в дистиллированной Н20. Готовят
непосредственно перед использованием1.
1 Можно приготовить 10%-ный раствор персульфата аммония н хранить
его при -20 °С по крайней мере месиц. - Прим. ред. пер.
350
Глава 6
Примечание: при растворении персульфата аммония хорошего качества
слышится потрескивание.
- Смесь этанол/ацетон (1 : 1).
- Смесь пропанол/вода (1:1).
6.7.2.3. Методика
Следует отметить, что в этой методике описано приготовление
неденатурирующего геля для проведения электрофореза на холоду (4°С),
чтобы свести к минимуму потерю ферментативной активности фракционируемых
белков. Тот же метод можно использовать для приготовления денатурирующего
геля, если в смесь для геля добавить 1%-ный ДСН. Электрофорез в
денатурирующем геле обычно проводят при комнатной температуре. Во время
работы следует надевать резиновые перчатки, поскольку акриламид
