Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
г.у.у'-.уГ'.."Ту'.-'.-- • • Т1 Волокнистая прослойка
- "I ¦¦ ..... Фильтровальная бумага
Катод
Рис. 6.16. Схема "полусухого" вестерн-блоттннга.
362
Глава 6
вся бумага и нитроцеллюлозный фильтр, ориентация которого отмечена
карандашом, были тщательно смочены TGM. Помещают гель на фильтр и
собирают остальную часть прибора. Между слоями удаляют пузырьки воздуха,
прокатывая их большой пипеткой.
Примечание: отрицательный (-) полюс (черный) должен быть со стороны
геля, а положительный ( + ) (красный) -со стороны нитроцеллюлозного
фильтра.
3. Осуществляют перенос в течение 1 ч при 500 мА и комнатной
температуре.
4. Вынимают нитроцеллюлозный фильтр из прибора и, если необходимо,
проявляют*) (см. стадию 10). Примечание: для остановки реакции промывают
фильтр дистиллированной Н20.
5. Инкубируют в растворе для блокирования (40 мл) 30 мин при 37 =С,
осторожно покачивая или встряхивая.
6. После блокирования инкубируют фильтр в 25 мл раствора первых антител
(антисыворотку к NPT-II разводят в 500 раз) в течение ночи при комнатной
температуре, осторожно покачивая или встряхивая.
7. Промывают фильтр в течение 1 ч одним литром TBS (пять смен по 200 мл
каждая).
8. Инкубируют в течение 1 ч в 25 мл раствора антител (антитела козы к
IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена и разведенные в 1000
раз); осторожно покачивают.
9. Промывают смесью TBS-твин, как указано на стадии 6.
!0. Оставляют фильтр в последнем растворе и смешивают компоненты
раствора для цветной реакции. Сливают последний раствор и сразу же
проявляют фильтр до тех пор, пока зоны не станут достаточно интенсивными
(это может занять 5-
10 мин).
11. Для остановки цветной реакции сливают раствор реагентов и погружают
фильтр в 7%-ную уксусную кислоту.
Примечания
а> Тканн растений часто содержат высокие уровни эндогенной пероксндазы,
н поэтому следует поставить соответствующие контроля (нетраисформи-
роваиный материал) либо необходимо выявить эндогенную активность до
•инкубации с антителами, просто проявив фильтр (стадии 10-11).
Анализ организации и экспрессии генов растений
363
6.9. Получение химерных генов
с последовательностями, кодирующими индикаторный фермент; система слияния
с геном GUS
6.9.1. Общие положения
6.9.1 .'1. Слияние геиов и индикаторные гены
Экспрессия генов контролируется на самых разнообразных уровнях,
включая инициацию транскрипции или трансляции, процессинг, транспорт или
распад мРНК либо белка. Экспрессия одного и того же гена может
регулироваться на одном или нескольких уровнях, что затрудняет
исследования определенного контролирующего элемента. Как же тогда изучать
отдельные элементы механизма, под контролем которого находится ген?
Точное слияние исследуемых генов с индикаторными представляет собой
изящный метод, позволяющий упростить эту задачу. Например, для
определения роли транскрипционного контроля необходимо удалить
большинство или все последовательности, кодирующие белок, включая
специфические сигналы для пост-трансляционной модификации, и заместить их
последовательностями хорошо изученного индикаторного гена.
Тот же подход используется и для изучения мультигенных семейств,
продукты которых очень схожи, но по-разному регулируются в процессе
развития. Сливая гены с отдельными элементами таких семейств и вводя
подобные конструкции в трансгенные растения, можно изучать экспрессию
генов этого семейства по отдельности.
Благодаря использованию чувствительных индикаторных ферментов в
значительной степени упрощается анализ генов, подвергшихся направленному
мутагенезу, если они введены в какие-либо организмы при трансформации.
Если использовать индикаторный ген, кодирующий фермент, который
отсутствует в изучаемом организме, то чувствительность выявления
химерного гена ограничена лишь свойствами индикаторного фермента и
методами его определения.
Для трансформации растений разработана система, где в качестве
индикаторного используют ген fi-глюкуронидазы E.coli. Р-Глюкуронидаза
(GUS, ЕС, 3.2,1,31), кодируемая [40] локу-сом udiA, представляет собой
гидролазу, которая катализирует расщепление многочисленных ^-
глюкуронидов, многие из которых имеются в продаже в качестве субстратов
для спектрофотометрического, флуориметрического и гистохимического
анализа. Ген ^-глюкуронидазы клонирован, и определена его полная
нуклеотидная последовательность. Он кодирует стабильный фермент,
обладающий необходимыми свойствами для создания
364
Глава б
слитых генов и их анализа [26]. Ген GUS обладает рядом преимуществ по
сравнению с другими индикаторными генами, используемыми для изучения
растений. Во-первых, многие растения, исследованные до сих пор, не
обладают глюкуронидазной активностью, и, таким образом, при изучении
экспрессии химерных генов обеспечивается нулевой фон. Во-вторых, глюку-
