Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 159

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 153 154 155 156 157 158 < 159 > 160 161 162 163 164 165 .. 184 >> Следующая

сигнала.
б) Активность NPT-II зависит от ионов магния; следовательно, для того,
чтобы реакция прошла эффективно, гель не должен содержать хелати-рующих
агентов типа ЭДТА н должен иметь достаточную концентрацию ионов магния.
в) Для удобства перенос можно оставить на ночь.
г) При этом удаляются все фосфорилированные белки, которые могли
связаться с бумагой.
6.8. Определение NPT-11 методом вестерн-блоттинга
6.8Л. Общие положения
Вестерн-блоттинг-это метод иммунологического выявления
электрофоретически разделенных антигенов, связанных с твердой подложкой.
В качестве подложки используют нитроцел-люлозный фильтр [8]. Разделение
обычно проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле в
присутствии ДСН. Такая система позволяет разделить белки по их мол.
массе, что повышает ценность метода, поскольку можно получить данные об
определенном антигене (никакими другими методами этого сделать нельзя).
Кроме определения массы вестерн-блоттинг можно использовать для выявления
антигена в изучаемом препарате белка; кроме того, можно определить его
относительное содержание, а также выяснить, подвержен ли этот белок
распаду.
После электрофоретического разделения белки переносят на
нитроцеллюлозный фильтр путем электроблоттинга, при этом они прочно
связываются с нитроцеллюлозной основой. Затем весь фильтр инкубируют в
растворе с высокой концентрацией 'белка (обычно это БСА, а недавно стали
использовать сухое молоко), чтобы блокировать неспецифическое связывание
моле-
358
Глава &
кул антител. После этого фильтр инкубируют со специфическими антителами
(обычно их получают из сыворотки кроликов), которые связываются с
соответствующими иммобилизованными антигенами. Образовавшийся комплекс
антиген - антитело можно выявить каким-либо методом, разработанным для
этой цели. Один из распространенных методов, известный как метод
сэндвича, основан на использовании меченых специфических,
антииммуноглобулинов. Например, если специфическая к антигену сыворотка
получена от кролика, то для выявления комплексов антиген - антитело
используют антитела к иммуноглобулинам кролика, полученные от козы или
осла. Такие антитела можно пометить различными способами: радиоизотопом
(например, 1251 и выявить радиоавтографией) либо ферментом небольшой мол.
массы (например, пероксидазой хрена или щелочной, фосфатазой и выявить с
помощью растворимого хромогенного субстрата, в результате реакции с
которым образуется нерастворимый продукт).
Известны и более простые методы выявления комплекса антиген- антитело.
Например, можно пометить специфичные к антигену антитела, но для этого из
соответствующей сыворотки необходимо выделить иммуноглобулины.
Модифицируя метод сэндвича, можно использовать меченный 1251 или золотом
белок А из Staphylococcus aureus, который специфически связывается с
иммуноглобулинами.
Вестерн-блоттинг - это исключительно чувствительный аналитический
метод. С его помощью в грубом белковом экстракте можно выявить до 50 нг
антигена, а в более чистых препаратах и еще меньшие количества. Хотя
здесь метод вестерн-блоттин-га описан как альтернативный анализу in situ
для выявления экспрессии NPT-II в трансформированных тканях (разд.
6.7.3), приведенные ниже методики можно оптимизировать для исследования
многих других белков. Хорошим примером служит работа Джонниса с
сотрудниками [29], где с помощью моноклональных антител к фитохрому
изучали молекулярные механизмы участия фитохрома в фотоморфогенных
ответах.
В данном разделе метод вестерн-блоттинга используется для выявления
экспрессии гена npt-II в трансформированных клетках моркови [50].
Антитела к NPT-II получали из сыворотки кролика, при этом животных
иммунизировали ферментом, выделенным из Е. coli с помощью стандартных
методов работы с белками (ионообменная [35] и аффинная [15]
хроматография). Показано, что NPT-II выявляется в виде одной иммуно-
реактивной зоны, обладающей той же электрофоретической подвижностью, что
и исходный бактериальный фермент. Эти результаты позволяют сделать ряд
заключений об экспрессии фермента в клетках растений: трансляция мРНК
гена nos-npt-II в
Анализ организации и экспрессии генов растений
359
клетках моркови приводит к образованию полипептида, идентичного
бактериальному ферменту: фермент не подвергается никакому специфическому
расщеплению или деградации, поскольку не обнаруживается каких-либо
низкомолекулярных иммуно-реактивных зон, которые бы свидетельствовали о
протеолити-ческом воздействии. Следовательно, NPT-II в клетках моркови
может быть относительно стабильной. Эти данные противоречат результатам
более ранних экспериментов по изучению стабильности NPT-II, которая
экспрессируется в трансформированных клетках табака [54], или фазеолина
бобов, экспрессируемого в трансформированных тканях подсолнечника [37]. В
этих случаях полипептиды подвергались частичной деградации, о чем
свидетельствуют зоны с меньшей мол. массой, обладающие NPT-II активностью
Предыдущая << 1 .. 153 154 155 156 157 158 < 159 > 160 161 162 163 164 165 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed