Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
са<-растений, выращенных на свету.
Анализ организации и экспрессии генов растений
341
ше не способен взаимодействовать со своей мишенью, с рибосомой. Эта
реакция переноса была использована для разработки чувствительного метода
анализа фермента в твердой фазе (разд. 6.7). Доступность такого типа
определения и тот факт, что фермент относительно нечувствителен к
присутствию N-koh-цевых пептидов, позволяют использовать NPT-II для
изучения пептидов, участвующих в переносе белков (транзитных пептидов).
В тканях высших растений хлоропласты представляют собой полуавтономные
образования, каждое из которых имеет собственный геном и систему
белкового синтеза. Однако большая
Рис. 6.13. Тканеспецифическая экспрессия гена Cab в целом растении.
Контроль (SR1), СаМЧ-cat и семена Cab-cat после трехнедельного
выращивания на твердой среде в присутствии (А) и в отсутствие (Б)
хлорамфеникола.
(ВМЦК тождественно CaMV.)
часть белков, обнаруживаемых в хлоропластах, кодируется ядерным геномом и
до перемещения в определенную органеллу обычно синтезируется на рибосомах
цитоплазмы в форме предшественников с большой мол. массой. Один из
наиболее хорошо изученных белков такого типа - малая субъединица (МС)
специфичной для хлоропластов рибулозо-1-5-бисфосфаткарбоксила-
зы/оксигеназы (РБФК/О). Молекула данного белка состоит из двух
субъединиц: большой, кодируемой геномом хлоропластов и синтезируемой в
них, и малой (МС РБФК/О), синтезируемой на свободных цитоплазматических
рибосомах в виде предшественника с мол. массой 20 000. В состав белка-
предшественника МС РБФК/О входит транзитный пептид (мол. масса 5000-
342
Глава 6
6000), который во время транспорта в хлоропласты протеоли-тически
отщепляется, и в результате образуется зрелая малая субъединица. Малые
субъединицы затем связываются с большими с образованием зрелого фермента.
Переносу белка-предшественника МС РБФК/О в хлоропласт предшествует
связывание с внешней мембраной хлоропласта. Удаление транзитного пептида
осуществляют специфические для этого белка протеиназы. Молекулярный
механизм данного процесса до конца не известен, однако полагают, что для
взаимодействия между транзитным пептидом и оболочкой"хлоропласта
необходимо, чтобы в состав пептида входили основные аминокислоты, а также
серин. Последовательности транзитных пептидов белков МС РБФК/О и Cab
различны, что, вероятно, связано с их различной локализацией внутри
хлоропласта. Однако в белках - предшественниках МС РБФК/О некоторых видов
растений обнаружены гомологичные области, окружающие сайт расщепления.
Область светового контроля I----------1
СААТ ТАТА I I
ATG
Область тканеспецифичного знхансера/сайпенсера
| | Промотор МС РБФКД)
Транзитный пептид
Кодирующан последовательность гена npt-U Рис,
6.14, Строение области слитого транслируемого гена МС РБФК/0-npt-II.
Свойства транзитных пептидов были изучены недавно путем их соединения
(вместе с промоторными участками) с "индикаторным" геном (npt-II) [49,
54]. Таким образом исследовали:
- Тканеспецифическую экспрессию продукта гена, который переносится
внутрь клетки в нужный компартмент.
- Локализацию белка в различных компартментах клетки.
- Расщепление химерного белка для удаления транзитного пептида.
В ниже описанных экспериментах (разд. 6.6 и 6.7) используют растения
табака SR1, трансформированные химерным геном, сконструированным на
основе гена белка МС РБФК/О пшеницы (рис. 6.14). Вся область, кодирующая
этот белок, за ис-
Анализ организации и экспрессии генов растений
343
ключением последовательности транзитного пептида и первого метионинового
кодона ATG, удалена и замещена бактериальным геном
неомицинфосфотрансферазы-П (NPT-II). Область промотора МС содержит б'-
последовательность длиной 33 п. н. (включая блок ТАТА), которая делает
экспрессию зависимой от света, и последовательность большего размера,
тоже расположенную в 5'-области, которая представляет собой специфический
для корней сайленсер.
В разд. 6.6 и 6.7 описаны методики, предназначенные для выявления
локализации химерного белка в органелле, а также тканеспецифической
экспрессии гена МС-npt-II (последовательность, кодирующая транзитный
пептид МС, соединенный с геном npt-II, и регулируемая промотором гена
МС). Для убедительности доказательства того, что транзитный пептид МС
РБФК/О способен доставить NPT-II в хлоропласты, необходимо показать, что
зрелая (протеолитически расщепленная) NPT-II содержится только внутри
хлоропластов растений, экспрессирующих химерный ген МС-яр/-П. Кроме того,
необходимо убедиться в том, что и NPT-II, лишенная транзитного пептида,
например синтезированная под контролем промотора гена nos, обычно ие
поступает в хлоропласты.
Для таких экспериментов препараты хлоропластов должны быть
