Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
- Нитроцеллюлозный фильтр (8x3 см), предварительно смоченный раствором
20XSSC и высушенный на воздухе.
- Водяная баня на 65 °С со штативом для пробирок Эппендорф.
- Покачиваемая водяная баня на 42°С.
- Кипящая водяная баня.
- Небольшая коробка с плотной крышкой из полипропилена. Растворы
- Двадцатикратный SSPE, см. разд. 5.5.2.
- 10%-ный ДСН.
- Стократный раствор Денхардта (2%-ный БСА: 2%-ный фи-колл 400, 2%-ный
поливинилпирролидон). На 100 мл:
БСА 2 г
Фиколл 400 (Sigma) 2 г
Поливинилпирролидон 2 г.
Слегка нагревая, растворяют в дистиллированной воде. Раз-
ливают соответствующие аликвоты (например, по 10 мл в пробирки со шлифом)
и хранят при -20 °С.
- Формамид (BDH Analar): деионизуют, добавив 5 г катио-но-
анионообменника на 100 мл (например, можно использовать Амберлит MG-1
фирмы BDH).
- ДНК спермы лосося (Sigma): растворяют в концентрации 10 мг/мл в
дистиллированной Н20, трижды озвучивают по 20 с, прогревают 10 мин на
кипящей водяной бане и хранят при -20 °С.
Анализ организации и экспрессии генов растений
329
- 20XSSC, см. разд. 5.4.2.
- Раствор А для отмывания: 2XSSC +0,1% ДСН.
- Раствор Б для отмывания: 0,2xSSC.
- Буфер для точечной гибридизации РНК на фильтре [50%-ный формамид,
6xSSPEa), пятикратный раствор Денхардта,
0,4%-ный ДСН, 0,2 мг/мл ДНК спермы лосося, 6%-ный полиэтиленгликоль
(6000 или 8000)]. На 100 мл:
Деионизованный формамид 50 мл
20xSSPEa) 30 мл
Юхраствор Денхардта 5 мл
10%-ный ДСН 4 мл
10 мг/мл ДНК спермы лосося 2 мл
ПЭГ (6000 или 8000) 6 г.
Каждый раз готовят свежий раствор.
•- Проба ДНК гена Cab, меченная 32Р (разд. 5.6).
- Препараты РНК с концентрацией 0,5 мг/мл, выделенные из проростков
гороха, как описано в разд. 4.7.3. Используют этиолированные проростки
после различных световых обработок согласно схеме, приведенной в табл.
6.2.
Таблица 6.2. Нанесение и обработка пятен при точечном блоттинге
Образец А, мкг В, мкг Обработка
1 0,1 1,0 Темнота, контроль
2 " " красным
3 " " Темнота+15 мин освещения дальним
красным светом
4 " ТемнотаН-6 мин освещения красным
светом+15 мин освещения дальним
красным светом
5 " Темнота+освещение белым светом
6.3.1.3. Методика
В клетках растений, выращенных на свету, в наибольшей концентрации
выявляется мРНК гена Cab. В данном эксперименте на фильтр в виде точек
наносят тотальную РНК лишь в двух концентрациях (0,1 и 1 мкг). Сравнивают
относительное содержание транскриптов гена Cab в недеградированных
препаратах тотальной РНК, выделенной из облученных проростков.
Чувствительность метода в случае молекул, выявляемых в меньшей
концентрации, может быть значительно повышена благодаря использованию
poly (А)+-мРНК. В меньшей степени чувствительность повышается при
увеличении количества наносимой тотальной РНК, вплоть до 5 мкг на точку.
330
Глава 6
1. Готовят в двух пробирках Эппендорф по два разведения каждого препарата
РНК так, чтобы их концентрация составляла 0,2 мг/мл и 0,02 мг/мл в 6XSSC:
РНК 20XSSC Н20
0,20 мг/мл 4,0 мкл 3,0 мкл 3,0 мкл
0,02 мг/мл 1,0 мкл 7,5 мкл 16,5 мкл.
2. Нагревают препараты в течение 15 мин при 65 °С на водяной бане для
денатурации РНК, затем охлаждают на льду. Наносят по 5,0 мкл каждого
разведения препарата в центр расчерченной области (слегка размечают
шариковой ручкой прямоугольники 1,5x3 см) фильтра, как указано в табл.
6.2. Фильтр следует поместить на невпитывающую поверхность (например,
"Парафильм"). Образец необходимо наносить очень медленно, чтобы
получились маленькие аккуратные точки диаметром 0,5-0,7 мм.
3. Когда точки высохнут, помещают нитроцеллюлозный фильтр внутрь
сложенного листа фильтровальной бумаги и нагревают в вакуумной печи при
80 °С в течение 1 чб>.
4. Помещают нитроцеллюлозный фильтр в коробку для гибридизации и заливают
25 мл гибридизационного буфера, стараясь избежать попадания пузырьков
воздуха. Инкубируют на покачиваемой водяной бане при 42°С в течение 1 ч.
5. Сливают буфер для гибридизации, однако нитроцеллюлозный фильтр(ы)
должен быть едва покрыт раствором. Нагревают меченую пробу на кипящей
водяной бане в течение 10 мин (обычно берут 10 нг пробы6)) и добавляют ее
в буфер для гибридизации, чтобы конечная концентрация составляла примерно
1-2 нг/мл. Инкубируют на покачиваемой водяной бане при 42 °С в течение
ночи либо по меньшей мере 12 ч.
6. Сливают гибридизационную смесь и дважды промывают фильтры по 20 мин в
растворе А для отмывания (раствор предварительно прогревают до 42°С).
