Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 146

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 140 141 142 143 144 145 < 146 > 147 148 149 150 151 152 .. 184 >> Следующая

полагать, что существует ряд гомологичных транскриптов, или же при
необходимости определить размеры транскрипта. Общая методика представлена
в приложении 6 [I]. Следует отметить, что но-
326
Глава 6
зерн-блоттинг не обладает такой чувствительностью, как точечный блоттинг.
6.3.1. Регуляция транскрипции гена Cab в этиолированном растении гороха
под действием фитохрома
6.3.].]. Общие положения
Во многих работах анализируют последовательности 5'-ДНК, расположенные
перед кодирующими участками генов" про экспрессию которых известно, что
она регулируется светом
Геномный клон РБФК/О гороха (МС РБ"К/о S-E9)
СААТ ТАТА
-1052 1L .. т ТТ
Ген РБФК/О гороха, перенесенный в петунию {МС РБФК/О S-
E9)
-13 | | Нет экспрессии
у Начало транскрипции
Д Делеция от -107 до -56
Рис. 6.6. Анализ регулируемой светом области гена МС РБФК/О гороха
методом делеционного мутагенеза и определения количества транскриптов в
трансгенном растении петунин.
и органоспецифична. Примером могут служить гены, кодирующие малую
субъединицу (МС) РБФК/О и белок, связывающий хлорофилл a/b (Cab).
Экспериментальные данные о 5'-последовательностях
Геномный клон rfecS-E9, содержащий ген МС РБФК/О гороха, содержит всю
5'-последовательность вплоть до -1052 (рис. 6.6). Если такой геномный
клон перенести в петунию, его
Анализ организации и экспрессии генов растений
327
транскрипция в каллусе происходит правильно и регулируется светом. С
помощью точечного нозерн-блоттинга изучали транскрипцию в делеционных
мутантах гена rbcS-E9 (рис. 6.6) в трансгенных тканях петунии [9]. Потеря
последовательностей от -1052 до -437 приводила к трехкратному снижению
уровня транскрипции на свету, однако не влияла на уровень транскрипции в
темноте. Делеция до -35 приводила к дальнейшему снижению уровня
транскрипции на свету, а делеция до -33 прекращала транскрипцию при любых
условиях. Делеция нуклеотидов от -352 до -35, включая блок СААТ, слабо
влияла на транскрипцию.
На основании этих данных можно сделать вывод, что 5'-по-
следовательность размером 33 п. н., включающая в себя блок ТАТА, - это
все, что требуется для обеспечения чувствитель-ности к свету. Интересно
отметить, что область между блоком ТАТА и сайтом САР сохраняется в ряде
клонов, несущих ген малой субъединицы и имеющих усредненную
последовательность GATTATATATAGC/A. Тканеспецифическая экспрессия
определяется лишь последовательностью до -352.
Фитохром как модулятор экспрессии генов
Фитохром участвует в самых разнообразных реакциях растений на
воздействие света, регуляции экспрессии генов, морфогенеза и других
физиологических процессов. Фитохром активен в весьма широком диапазоне
интенсивности света. Фитохром существует в двух формах, Рг и Pfr, которые
могут переходить одна в другую с максимумами поглощения при 660 и 730 нм
соответственно. При освещении светом с широким спектром возникающее
равновесие фитохромов (соотношение уровней Рг и Pfr) зависит от
соотношения красного и дальнего красного света и практически не зависит
от уровня потока фотонов. В описанном ниже эксперименте используют
растения, выросшие в темноте (этиолированные), которые содержат лишь одну
форму фитохрома, Pfr, в которой он синтезируется. Короткое облучение
красным светом обеспечивает превращение практически всего Pfr в Рг, хотя
небольшое количество Pfr сохраняется, поскольку эта форма слабо поглощает
при 660 нм. К изменениям экспрессии генов, которые, как показано,
происходят после облучения красным светом, относятся: повышение синтеза
МС и Cab, уменьшение содержания НАДФН-прото-хлорофиллид-оксидоредуктазы
(ПХР) и снижение количества фитохрома (последний саморегулируется по
крайней мере в этиолированном овсе). Такие изменения в большой степени
могут быть обратимы при освещении после красного света дальним красным.
Уровни темновой транскрипции никогда не восстанавливаются вследствие
неполного превращения Pfr в
328
Глава 6
Рг, поскольку Рг обладает некоторым поглощением при длинах волн около 730
нм. Именно поэтому освещение растений, выращенных в темноте, дальним
красным светом приводит к тому же результату, что и освещение красным
светом, хотя и в меньшей степени.
В приведенном ниже эксперименте изучали регулируемую фитохромом
транскрипцию собственных генов Cab у этиолированного растения гороха. РНК
из гороха, выращенного в разных режимах освещения, выделяли, как описано
в разд. 4.7. Цель эксперимента - определение в каждом образце уровня
транскрипции мРНК с генов Cab методом количественного точечного нозерн-
блоттинга. В качестве пробы для гибридизации использовали клоны кДНК гена
Cab.
6.3.1.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I])-.
Предыдущая << 1 .. 140 141 142 143 144 145 < 146 > 147 148 149 150 151 152 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed