Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
7. Промывают фильтр в течение 15 мин в предварительно подогретом растворе
Б для отмывания.
8. Высушивают фильтр на воздухе, прикладывают к куску бумаги Whatman 3
ММ, обертывают пленкой (Saran Wrap) и в зависимости от силы сигнала
экспонируют с пленкой Hyperfilm от нескольких часов до нескольких дней.
9. Типичный для описываемого эксперимента радиоавтограф
представлен на рис. 6.7. Хорошо видно, что количество транскриптов
гена Cab в темноте (1) гораздо ниже, чем при освещении белым светом (5).
В пользу участия фитохрома в этом процессе свидетельствует следующее:
содержание
транскриптов генов Cab в препаратах тотальной РНК возрастает после
освещения красным светом (2), а не дальним
Анализ организации и экспрессии генов растений
331
красным светом (3); кроме того, данные указывают на то, что повышенный
по сравнению с темнотой уровень транскрипции при красном свете может быть
частично снижен облучением дальним красным светом (4).
Примечания
а) SSPE в присутствии формамида обладает несколько большей буферной
емкостью, чем SSC.
б) Пробы данного объема и концентрации достаточно для шести ннтроцел-
люлозных фильтров указанного размера.
Ф
Темнота Красный
Рис. 6.7. Контроль транскрипции гена Cab под действием фитохрома в
этиолированных проростках гороха. Точечный нозерн-блоттинг тотальной
мРНК, выделенной из растущих на свету растений и этиолированных
проростков гороха через 16 ч после различных световых обработок. А - 0,1
мкг мРНК; Б -
1,0 мкг мРНК. Обработка: 1-темновой контроль; 2 - выращивание в темноте
с 6-мин облучением красным светом; 3-выращивание в темноте с 15-мин
облучением дальним красным светом; 4 - выращивание в темноте с 6-мин
облучением красным светом, за которым сразу же следует облучение дальним
краевым светом в течение 15 мин; 5 - проростки, выращенные на свету.
6.4. Использование CAT в качестве индикаторного гена для изучения
контроля экспрессии генов в различных органах и при изменении условий
среды
6.4.1. Общие положения
Как фитохром участвует в световой регуляции генов типа Cab? В
последнее время несколько групп исследователей попытались ответить на
этот вопрос, сперва идентифицируя, а затем селективно изменяя ^ис-
действующие регуляторные элементы ненов, активность которых регулируется
светом. В этом отно-
W
Дальний Красный/
красный дальний красный
Свет
332
Глава 6
jj.4COCHCI2
¦n^L-
Ацетил-КоА
1,3 Ac Cm
. 3 Ac Cm
1 Ac Cm Cm
Рис. 6.8. Радиометрическое определение хлорамфениколацетилтраисферазы.
А. Структура хлорамфеникола с указанием сайтов ацетилирования при участии
CAT.
Б. Радиоавтограф пластинки ТСХ для определения CAT с указанием
положения трех форм ацетилированиого (1-ацетил-, 3-ацетил- и 1,3-
диацетнлхлорам-феникола) и неацетилированиого хлорамфеникола.
Анализ организации и экспрессии генов растений
333
шении наиболее хорошо изучены гены малой субъединицы (МС) рибулозо-1,5-
бисфосфагкарбоксилазы (РБФК) и хлорофилл а/Ь-связывающего белка (Cab).
Синтез указанных белков зависит от светового облучения. Как мы уже
отмечали во введении к данной главе, для успешного изучения регуляторных
последовательностей этих генов их соединяют с индикаторными генами,
кодирующими фермент (например, npt-II и cat/c) с последующим анализом
экспрессии химерного гена в трансгенных растениях. Ген cat из транспозона
Тп9 придает бактерии устойчивость к хлорамфениколу. Его используют в
качестве индикаторного при трансформации клеток как животных [16, 17],
так и растений [10, 14, 23, 24, 25, 39]. "Популярность" данного гена
обусловлена рядом причин: его легко выделять в больших количествах из
бактерий, содержащих мультикопийную плазмиду, в состав которой входит
Тп9, либо из рекомбинантной плазмиды типа pBR325 [5], содержащей только
ген cat. Кодирующая последовательность этого гена невелика (700 п. н.),
и, следовательно, с ним легко работать. Кроме того, для выявления
продукта гена cat (хлорамфениколацетилтрансферазы, CAT) разработан
довольно простой радиометрический анализ в жидкой фазе.
6.4.2. Определение активности хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT)
6.4.2.1. Общие положения
CAT инактивирует хлорамфеникол посредством ацетилиро-вания двух сайтов
молекулы антибиотика (рис. 6.8, А). Таким, образом, в результате реакции
образуются три формы ацетилиро-ванного хлорамфеникола: две промежуточные
формы моноацетатов (1-ацетилхлорамфеникол и 3-ацетилхлорамфеникол), а при
протекании реакции до конца - диацетатная форма (1,3-диаце-
тилхлорамфеникол). Излагаемое в данном разделе определение активности CAT
основано на том, что неацетилированный хлорамфеникол и три формы
ацетилированного хлорамфеникола обладают различной растворимостью в
хлороформе и, следовательно, разделяются методом тонкослойной
хроматографии (ТСХ), если в качестве элюента используют хлороформ.
