Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Глава &
собирают нижнюю зону (на границе 10%- и 3%-ного фикол-ла) и переносят
во флакон - в этой зоне содержатся ин-тактные хлоропласты. Доводят до 20
мл холодным одно* кратным CIB и вновь центрифугируют, чтобы осадить
хлоропласты (стадия 4).
8. Удаляют супернатант, суспендируют осадок в 300 мл однократного CIB и
переносят в пробирку Эппендорф.
9. Помещают на лед, добавив 3,0 мкл раствора трипсина, ноставляют на 30
мин.
10. Наполняют пробирку до верха однократным CIB. Центрифугируют в мини-
центрифуге на низкой скорости 1 мин, удаляют супернатант, добавляют 100
мкл буфера для лизиса хлоропластов, который содержит ингибитор трипсина,
и перемешивают. Помещают образец на лед и затем используют для
определения активности NPT-II (разд. 6.7.3).
6.7. Определение активности NPT-11 in situ
6.7.1. Общие положения
Радиометрическое определение активности NPT-II в экстрактах, клеток
прокариот
Несколько лет назад был разработан удобный и весьма чувствительный
метод радиометрического анализа, позволяющий определять активность NPT в
бактериальных экстрактах. При этом используют АТР, в котором фосфор
концевой (у) фосфатной группы замещен на радиоактивный изотоп 32Р. При
ферментативной реакции NPT-II переносит радиоактивный фосфат с у.з2р дхр
на антибиотик, который вследствие этого становится радиоактивным. Чтобы
количественно определить продукты этой реакции, радиоактивный
фосфорилированный антибиотик следует каким-либо образом отделить от
высокорадиоактивного АТР. Для этого используют специальную ионообменную
бумагу (фосфоцеллюлозу Whatman Р81), которая при pH проведения реакции
связывает только антибиотик. Реакционную смесь наносят на поверхность
небольшого куска бумаги и свободный АТР затем просто смывают с бумаги
горячим фосфатным буфером, после чего бумагу высушивают и количество
связывающейся метки определяют в сцинтилляционном счетчике.
Радиометрическое определение активности NPT-II в экстрактах клеток
эукариот
К сожалению, метод, используемый для определения активности NPT-II
прокариот, не может применяться для определения NPT-II в клетках
эукариот. Во всех эукариотических клетках отмечается высокий уровень
эндогенной АТРазкой актив-
Анализ организации и экспрессии генов растений
347
ности, которая конкурирует с NPT-II за меченый АТР. Если уровень NPT-II
высок, как, например, в бактериальной клетке, то фермента достаточно для
преодоления такой конкуренции и образования определимых количеств
фосфорилированного кана-мицина. Однако в чужеродном окружении
(эукариотические клетки), когда экспрессия гена NPT-II контролируется
чужеродным промотором, уровень фермента обычно значительно ниже по
сравнению с конкурирующей активностью, и, следовательно, его
недостаточно, чтобы преодолеть конкуренцию за АТР. В результате анализ
может показать, что фермент отсутствует в экстракте.
Наиболее простой путь для преодоления этой проблемы-¦предварительное
разделение активностей NPT-II и АТРазы.Для этого разработан ряд методов,
наиболее удобный из которых основан на фракционировании с помощью
неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле [46]. Из
исследуемого материала на холоду в присутствии смеси ингибиторов про-
теиназ готовят бесклеточные экстракты и фракционируют их методом
электрофореза. Гель, содержащий фракционированный экстракт, вынимают из
прибора и уравновешивают соответствующим буфером, который используют для
проведения реакции. Фермент затем должен взаимодействовать с кофакторами
и субстратами; это достигается путем иммобилизации их в слое агарозы,
плавящейся при низких температурах. На поверхность акриламидного геля
наливают агарозу, и она застывает. Реакцию проводят, как и в обычной
жидкой фазе, и образующийся в результате фосфорилированный канамицин
переносится затем с геля на лист фосфоцеллюлозной бумаги посредством
капиллярных сил, как при блоттинге по Саузерну. Бумагу затем промывают,
как описано выше, но в данном случае радиоактивный канамицин выявляют
радиоавтографией. Судя по сообщениям, чувствительность данного метода
позволяет в оптимальных условиях (чистый препарат фермента) обнаружить 1
нг активного фермента, но значительно снижается при использовании
неочищенных препаратов. Известен и другой метод определения NPT-II с
помощью специфических антител и вестерн-блоттинга (разд. 6.8).
Эксперимент, описанный в данном разделе, иллюстрирует некоторые общие
положения метода на примере переноса продукта гена Ж-npt-II в
хлоропласты.
6.7.2. Неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле
Полный обзор данного метода опубликован Хэймсом [20]. В данном
разделе приведено лишь схематичное его описание для определения NPT-II in
situ. В .связя с тем что при любых
348
Глава 6
pH, кроме изоэлектрической точки, белковые молекулы обладав ют
поверхностным зарядом (причем величина этого заряда у разных белков
варьирует), в электрическом поле они движутся с разными скоростями. Хотя
