Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
поскольку это дможет привести к взрывоподобному испарению и потере
образца. При умеренном вакууме данная стадия может занимать до 5 ч.
и> Метанол улучшает относительное разделение трех ацетилированных форм
хлорамфеникола.
к) Каждый раз готовят свежий раствор, поскольку хлороформ весьма летуч.
6.4.3. Примеры использования cat в качестве индикаторного гена для
изучения контроля экспрессии гена Cab-cat в различных органах и в
зависимости от условий среды
Надь с соавторами [39] соединил фрагмент, расположенный на 5'-конце
гена Cab пшеницы (Cab), с кодирующей областью гена cat. Эта конструкция
была перенесена в клетки ¦ табака, и оказалось, что сама по себе
последовательность, расположенная с 5'-конца гена СаЬ,- может придавать
гену cat как способность к регуляции фитохромом, так и
тканеспецифичность. На рис. 6.9,Л представлена конструкция СаЪ-cat,
весьма сход-
A Cab- cat
Область
светового контроля-
СААТ ТАТА
ATG
Б ВМЦК- cat
ATG
| ~~| Промото^ Cab
Кодирующая последовательность гена
Промотор ВМЦК-35
Сигнал
полиаденилировани^
Рис. 6,9. Строение участков слитых геиов Cab-cal и CaMV-catf,
подлежащих транскрипции. (ВМЦК тождественно CaMV.)
Анализ организации и экспрессии генов растений
337
ная с той, которую использовали Надь и соавторы [39]. Такую конструкцию
переносили в клетки табака и применяли в экспериментах по изучению
регуляции экспрессии этих последовательностей. Активность промотора гена
Cab(Cab) сравнивали с конститутивно экспрессирующимся промотором 35S
(рис. 6.9,Б) вируса мозаики цветной капусты (рис. 6.9,Б).
6.4.3.1. Сравнение экспрессии химерного гена Gab-cat в траисгенных
растениях иа свету и в темноте
Световую регуляцию экспрессии гена Cab-cat в трансгенных растениях
можно выявить, сравнивая активности CAT в ткани листьев растений,
выросших на свету и в темноте. Проще всего провести подобный эксперимент
на двух растениях, из которых одно за 4-5 дней до опыта выращивают в
темноте, а другое содержат при нормальном режиме свет/темнота. Однако
такая постановка опыта все же не может считаться удовлетворительной,
поскольку результаты могут объясняться разницей между отдельными
растениями (например, влияние эффекта "положения" вставки Т-ДНК), а не
световой обработкой. Самый простой способ решения этой задачи -
размножить одно трансгенное растение и получить в потомстве как минимум
два клонированных растения. Поскольку такие растения идентичны, это
устранит возможное влияние генетических различий на результаты
эксперимента. Для проведения эксперимента одно из клонированных растений
в течение 7-10 дней выращивают в темноте, и за это время все новые побеги
оказываются этиолированными. Сравнение активности CAT в клонах, выросших
на свету (5) и в темноте (6), свидетельствует о том, что экспрессия гена
Cab-cat стимулируется светом (рис. 6.10). Контрольные пятна (3 и 4)
показывают, что экспрессия промотора 35S CaMV в меньшей степени зависит
от света. Снижение активности CAT в растениях, содержащих cat-CaMV и
выросших в темноте, вероятно, является косвенным последствием отсутствия
света,а не результатом специфической регуляции светом. Проводя
эксперименты такого типа, важно оптимизировать продолжительность темновой
обработки, чтобы максимально усилить специфические эффекты экспрессии
гена и свести к минимуму общее действие, вызванное голоданием. Кроме
подтверждения световой регуляции результаты эксперимента свидетельствуют
и о том, что промотор 35S CaMV обеспечивает гораздо более эффективную
экспрессию гена cat, чем промотор гена Cab (сравните сигнал на дорожках 3
и 5). Отсутствие пятен на дорожке 2 указывает на то, что растения табака
дикого типа SR1 проявляют очень низкую активность ацетилирования
хлорамфеникола.
338
Глава в
6.4.3.2. Регуляция экспрессии гена Cab-cat фитохромом
Для изучения роли фитохрома в световой регуляции гена Cab-cat
необходимы более тонкие эксперименты, которые способны показать, что
экспрессия этого гена может меняться в зависимости от кратковременного
облучения красным и дальним красным светом. Подобные опыты лучше всего
проводить с 7- 14-дневными этиолированными проростками, полученными из
стерильных семян, замоченных в культуральной среде с последующей
инкубацией в полной темноте (подробнее о проращи-
•1 2 3 4
5 6
Рис. 6.10. Использование системы маркерного гена Cat для выявления
световой регуляции экспрессии геиа Cab в трансгенных растениях табака. 1
- положительный контроль, содержащий бактериальную CAT; 2 - контрольные
