Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Добавление 5% метанола делает эффект более явным, и поэтому метанол тоже
включают в состав элюента. В качестве субстрата используют радиоактивно
меченный 14С хлорамфецикол и, кроме того, в реакцию добавляют кофактор
ацетил-КоА. Описанный ниже метод определения активности CAT применим в
случае самых разнообразных экстрактов тканей, полученных, как указано в
разд. 3.3.2 и 6.4.3.
334
Глава 6
6.4.2.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Пластмассовые мешалки (Sarstedt).
- Ультразвуковая установка с микронасадкой.
- Смеситель "Вортекс".
- Водяные бани на 37 и 65 °С.
- Пластинки для ТСХ (например, Merck Kieselgel, кат. №5729) и резервуар
для них.
- Кассета для экспонирования с рентгеновской пленкой.
Растворы
- Контрольный раствор, обладающий CAT-активностью: например, тотальный
экстракт штамма E.coli, несущего pBR325 (см. приложение 6 [II]), либо
очищенная CAT, имеющаяся в продаже*).
- Лейпептин, 10 мг/мл (Sigma): растворяют в дистиллированной Н20,
хранят при -20 °С.
- Буфер для экстракции (0,25 М трис-НС1, pH 7,8; 0,5 мМ лейпептин).
На 10 мл:
2,0 М трис-HCl, pH 7,8 1,25 мл
10 мг/мл лейпептин 0,24 мл
Доводят до 10 мл дистиллированной Н20. Хранят при -20 °С
в течение месяца.
- Раствор 14С-хлорамфеникола: D-трео-(дихлорацетил-1-14С)
хлорамфеникол (Amersham СА.515; 50-60 Ки/ммоль; 1,85- 2,2 ГБк/ммоль).
Как правило, раствор не разводят.
- Раствор ацетил-КоА: растворяют 10,0 мг ацетил-КоА (Sigma, кат. № А-
2897) в 50 мкл дистиллированной Н20. Готовят непосредственно перед
использованием.
- Растворитель хлороформ/метанол (95:5).
6.4.2.3. Методика
1. Протопласты: собирают клетки, полученные из протопластов,
обработанных вектором (разд. 3.2 и 3.3), путем центрифугирования в
пробирках Эппендорф на малых скоростях. Удаляют супернатант, добавляют
равный объем буфера для экстракции CAT ( - 100 мкл) и дважды озвучивают
на льду по 30 с, охлаждая в промежутке в течение 30 с. Зрелые растения
или ткань проростков: собирают 100 мг (удаляют среднюю жилку и крупные
сосуды) и разбивают пластмассовой мешалкой в 100 мкл буфера для
экстракции САТб).
Анализ организации и экспрессии генов растений
335
2. Инкубируют экстракты при 65 °С в течение 1 минв>.
3. Смешивают экстракты с 1,0 мкл 14С-хлорамфеникола (0,0074 МБк, 0,2
мкКи/образец, конечная концентрация) и
3,0 мкл раствора ацетил-КоАг). Ставят аналогичную реакцию, взяв 50а>
мкл контрольного бактериального экстракта, обладающего САТ-активностью.
4. Инкубируют при 37 °С 60 мннд>.
5. Добавляют 300 мкл этилацетатае> и тщательно перемешивают на
"Вортексе".
6. Центрифугируют в течение 2 мин на большой скорости в мини-центрифуге
и затем переносят этилацетат (верхний слой) в чистую пробирку Эппендорф.
Стараются не захватить водную фазуж).
7. Полностью выпаривают этилацетат под вакуумом в эксикаторе3).
8. Добавляют 20 мкл этилацетата и перерастворяют хлорам-феникол,
встряхивая на "Вортексе" в течение 30 с.
9. Наносят образцы вдоль края пластинки для ТСХ, отступая 1 см от края
и с промежутками около 1,25 см между образцами.
10. Выстилают внутреннюю поверхность резервуара для ТСХ фильтровальной
бумагой (Whatman 3 ММ), чтобы поддерживать равновесие фаз, и заливают его
смесью хлороформ/метанол11) в соотношении 95 : 5К) на глубину 0,5 см. Для
проведения хроматографии погружают пластинку в резервуар, прислонив ее к
стенке, причем конец пластинки, на который нанесены образцы, должен
находиться в элюенте. Закрывают резервуар крышкой и ждут, пока фронт
растворителя не достигнет верха пластинки (20-30 мин).
11. Вынимают пластинку из резервуара, высушивают на воздухе и подвергают
радиоавтографии в течение 12-24 ч. При участии бактериальной CAT, как
правило, образуются все три формы ацетилированного хлорамфеникола (Cm) и
небольшое количество неацетилированного (рис. 6.8,Б). Если реакция прошла
до конца, то в основном образуется диацетат, а неацетилированный
хлорамфеникол может не обнаруживаться.
Примечания
*> 1-10 единиц очищенной CAT, предлагаемой рядом поставщиков, включая
Pharmacia, P-L Biochemicals, Sigma.
(r)) Имеются сообщения и об использовании более сложных буферов, ио,
согласно нашему опыту, это в конечном счете снижает эффективность
реакции.
(r)) Обработка инактивирует компоненты грубого растительного экстракта,
ингибирующие активность CAT.
336
Глава 6
г> Раствор ацетил-КоА весьма нестабилен, и его либо следует готовить
заново, либо хранить при -20 °С не более 10 дней. д> Если добавить
достаточное количество активного ацетил-КоА, время инкубации может быть
увеличено до 60 мин. е> Этилацетат - сильный растворитель, и его можно
набирать лишь стеклянными пипетками либо наконечниками типа Gilson. ж>
Попавшая в конечный экстракт вода испортит хроматограмму.
3) На этой стадии следует избегать слишком быстрого установления вакуума,
