Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
растения табака, выращенные на овету (SR1); 3 - выращенные на свету
растения
СаМV-cat; 4- выдержанные в темноте растения CaNYV-cat\ 5-выращенные на
свету растения Cab-cat; 6 - выращенные в темноте растения Cab-cat.
вании семян см. разд. 2.5.2.2). Такая постановка эксперимента приводит к
тому, что до световой обработки активность CAT не обнаруживается и, кроме
того, облегчает работу с материалом, Короткое освещение проростков,
несущих ген Cab-cat, красным светом стимулирует синтез CAT в ткани листа,
который постепенно достигает максимума через 16 ч после обработки (рис.
6.11, дорожки L и R). Полученный эффект может быть обратим, если вслед за
красным светом растения сразу же облу-
Анализ организации и экспрессии генов растений
339
чить дальним красным светом (FR). Такой тип экспрессии характерен для
генов, регуляция которых зависит от фитохрома. Сила ответа может быть
проиллюстрирована тем фактом, что уровень экспрессии CAT в проростках,
освещенных красным светом (R), достигает уровня экспрессии в проростках,
выращенных на свету, а обращение эффекта, вызванное облучением дальним
красным светом, приводит к тому, что уровень экспрессии CAT не превышает
уровня синтеза этого фермента в темноте (D).
6.4.3.3. Органоспецифическая экспрессия химерного гена Cab-cat
Новосинтезированный Cab транспортируется в хлоропласт, где входит в
состав светособирающего комплекса тилакоидных [1] мембран. Однако такие
белки синтезируются не во всех
L. L "
0 .R-
FR
Рис. 6.11. Контроль экспрессии гена Cab под действием фигохрома. 14-
дневные проростки табака Cab-cat, как выращенные на свету, так и
этиолированные, облучаемые светом, с различной длиной волн и затем
помещенные в темноту. Определение CAT проводилось через 16 ч после
облучения. L - постоянный белый свет; D - постоянная темнота; R - темнота
и 6-мин облучение красным светом; FR - темнота и 6-мин облучение красным
светом, за которым сразу же следует 15-мин освещение дальним красным
светом.
клетках растения. Сходным образом зрелые функционирующие хлоропласты
неравномерно распределены по всем клеткам растения. Больше всего их в
фотосинтезирующих тканях листа, меньше - в ткани стебля, и обычно
хлоропласты почти полностью отсутствуют в ткани корня. Оказалось, что
транскрипция с промотора гена Cab зависит от прилежащих к нему по-,
следовательностей энхансера и сайленсера (подробнее см. разд.6.1),
которые отвечают за то, что любой ген, находящийся под их контролем (ген
Cab в естественном окружении), экспрессируется только в тех органах, где
обнаружены хлоропласты. Результаты, представленные на рис. 6.12, ясно
подтверждают, что это происходит, когда ген cat находится под контролем
промотора гена Cab, причем максимальные уровни CAT обнаруживаются в
листьях (L), меньшее количество - в стебле (S) и в
340
Глава 6
наименьшей степени (либо вообще не обнаруживаются) -в
корнях (R).
Тканеспецифическую экспрессию гена Cab-cat
можно выявить и в целом растении. Контрольные семена с конструкциями Cab-
cat и СаМV-cat проращивают в присутствии 25 мкг/мл хлорамфеникола. Как
показано па рис. 6.13, проростки CaNW-cat полностью устойчивы к
антибиотику, а проростки СаЪ-cat лишь ненамного более устойчивы, чем
контрольные проростки SR1. Такое различное воздействие хлорамфеникола на
эти проростки выражено весьма отчетливо вопреки тому, чго все ткани листа
как Cab-cat-, так и СaNW-cat-pастений содержат легко выявляемые уровни
активности CAT (рис. 6.10). Результаты предыдущего эксперимента позволяют
предположить, что именно отсутствие активости CAT в корнях СаЬ-са?-
растений определяет их чувствительность к хлорамфениколу. Таким образом,
результаты данного эксперимента убедительно показывают, что промо-торная
последовательность гена Cab на уровне всего фенотипа тканеспецифична. В
этом случае в корнях функционирует специфический "сайленсер".
6.5. Применение неомицинфосфотрансферазы-Н (NPT-II) в качестве
индикаторного белка для изучения роли последовательностей, участвующих в
переносе белков (транзитных пептидов)
6.5.1. Общие положения
Неомицинфосфотрансфераза-Н (NTP-II) представляет собой бактериальный
фермент небольшой мол. массы (25 кДа), который катализирует о-
фосфорилирование ряда аминогликозидных антибиотиков, например неомицина,
канамицина и антибиотика G418. Реакция осуществляется посредством
переноса '(-фосфатной группы АТР на молекулу антибиотика, что приводит к
нарушению его функциональной активности, поскольку он боль-
м
т т
I- * -
Рис. 6.12. Тканеспецифмческая экспрессия гена Cab в трансгенных растениях
табака. CAT определяли в листьях (L), стебле (S) и корнях (R) зрелых СаЬ-
