Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
представляет собой нейротоксин с кумулятивным действием и особенно опасен
в виде мономера.
1. Моют стеклянные пластины сперва детергентом (например, 0,1%-ным
Деконом), затем смесью этанол/ацетон (1:1). Высушивают на воздухе.
2. Собирают блоки для геля с соответствующими спейоерами (например,
толщиной 1-2 мм), удерживая их вместе клипсами (если требуется), и
запаивают горячей агарозой (100°С, 1%) с высокой температурой плавления.
3. Смешивают в колбе Бюхнера объемом 250 мл реактивы
в следующем порядке, добавляя ТЕМЕД и персульфат после дегазирования.
Этой смеси достаточно для заливки 10%-но-го разделяющего геля объемом
около 37 млЧ Акриламид/бисакриламид (30:0,8%) 13,4 мл
1 М трис-НС1, pH 8,8 15,0 л
Дистиллированная Н20 7,0 мл
Дегазируют в течение 1 мин ТЕМЕД
20,0 мкл
1,5%-ный персульфат аммония 2,0 мл
4. Заливают раствор между стеклянными пластинками, оставляя пространство
для помещения гребенки и заливки концентрирующего геля на толщину 2-3 см.
5. Осторожно наслаивают пастеровской пипеткой 1-2 мл смеси пропанол/вода
(1:1).
6. Дают гелю заполимеризоваться в течение 30-60 мин, о чем можно судить
по образованию четкой границы между гелем и наслоенным на него раствором.
7. Отсасывают жидкость над гелем и осторожно промывают поверхность геля
дистиллированной Н20. Удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой.
Анализ организации и экспрессии генов растений
351
8. Готовят концентрирующий гель, смешивая в следующем по-
рядкеа>:
Акриламид/бисакриламид (30:0,8%) 2,5 мл
1 м трис-HCl, pH 6,8 2,5 мл
Дистиллированная Н20 13,8 мл
Дегазируют в течение 1 мин ТЕМЕД
5,0 мкл
1,5%-ный персульфат аммония 1,0 мл
9. Заливают между стеклянными пластинками раствор концентрирующего геля.
10. Вставляют гребенку (Осторожно: акриламид может выплеснуться!) и
оставляют примерно на 15 мин6) для полимеризации, контролируя этот
процесс по образованию четко выраженной границы вдоль краев геля.
11. Сразу же после полимеризации удаляют гребенку и промывают лунки
однократным буфером для электрофореза. Искривленные лунки следует
выправить иглой от шприца.
12. Заливают в нижнюю камеру однократный буфер для электрофореза. Удаляют
нижний спейсер между стеклянными пластинками и наклонно погружают их в
нижнюю камеру. Удаляют все пузырьки воздуха, оказавшиеся между
пластинами. Помещают пластины на подпорки на дне нижней камеры и
прикрепляют к верхней камере клипсами. Заполняют верхнюю камеру
однократным буфером для электрофореза.
13. Выравнивают температуру собранного прибора, поместив его на 30 мин в
холодную комнату при температуре 4 °СВ).
14. Осторожно наносят каждый образец (подробнее о приготовлении образцов
см. в разд. 6.7.3.2) в лунки с помощью автоматической пипетки Gilsonr>
или шприца фирмы Hamilton.
15. Проводят электрофорез (Примечание: белки мигрируют от минуса к плюсу,
см. также примечание к разд. 5.3.3) до тех пор, пока фронт краски не
окажется на расстоянии 1-2 см от дна. Гель толщиной 1,5 мм и длиной 15,0
см необходимо подвергать электрофорезу в течение 16 ч при 100 Вд>.
16. Отключают источник напряжения и осторожно разделяют пластины.
Примечание: во избежание повреждения в качестве рычага следует
использовать тонкий шпатель. Поместив гель на стеклянной пластинке,
осторожно удаляют концентрирующий гель. При работе с гелем следует
использовать безопасную бритву и обрубать, а не резать гель1.
1 Прн разрезаннн геля удобно использовать острое колесико с рукояткой,
которое предназначено для. нарезания теста для печенья. - Прим. ред. пер.
352
Глава Ь
Примечания
ж) Для приготовления денатурирующего геля следует добавлять и 0,1% ДСН.
(r)> Не рекомендуется оставлять на длительное время, поскольку гребенку
будет очень трудно вынуть, не повредив при этом лунки.
*) Электрофорез в денатурирующем геле, содержащем ДСН, обычно проводят
прн комнатной температуре.
г> Некоторые гели могут оказаться слишком тонкими, чтобы можно было, не
загрязняя соседние лункн, использовать для нанесения автоматическую
пипетку типа Gilson. Вероятно, лучше использовать микрошпрнц (их
выпускает фирма Hamilton) либо приспособление для нанесения с капилляром.
д) Электрофорез в неденатурнрующем геле проходит относительно медленно,
поскольку в геле и буфере для электрофореза отсутствует ДСН.
6.7.3. Определение NPT-II in situ после электрофореза
6.7.3.1. Общие положения
Хотя определенные активности NPT-II in situ (см. полное описание в
разд. 6.7.1) особенно удобны для изучения транзитных пептидов и в данном
разделе метод иллюстрируется именно этим примером, изначально он был
разработан для анализа экспрессии химерных генов npt-II в
трансформированных клетках животных и растений [24, 46]. Такое
