Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 157

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 151 152 153 154 155 156 < 157 > 158 159 160 161 162 163 .. 184 >> Следующая

определение является полуколичественным и позволяет выявить влияние
определенного типа промотора (например, nos по сравнению с 35S CaMV [48])
и дозы гена [44], а также зависимость уровня экспрессии химерных генов
npt-II в трансформированных тканях растения от положения в геноме [29,
39].
Для определения проводят электрофорез в неденатурирующем
полиакриламидном геле, который подробно описан выше (разд. 6.7.2). На
стадии 3 используют электрофорез в неденатурирующем 10%-ном акриламидном
геле. Вся процедура занимает около 24 ч: следует приготовить гель,
поместить его в прибор для электрофореза и охладить до 4 °С. Во время
охлаждения готовят образцы, затем их наслаивают на гель и проводят
электрофорез в течение ночи. На следующий день завершают .анализ, и, если
получен хороший сигнал, первые радиоавтографы могут быть готовы уже в тот
же день.
6.7.3.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Холодная комната на 4°С.
Анализ организации и экспрессии генов растений
353
- Образцы растительной ткани: трансформанты и контроль.
- Контрольные экстракты NPT-II из бактерий (приложение
6 [II]).
- Одноразовые пластмассовые палочки (Sarstedt).
- Пластмассовая коробка (Steward plastics).
- Водяные бани на 37 °С и с кипящей водой.
- Агароза с низкой температурой плавления (2%).
- Пластинка для анализа (стеклянная пластинка примерно того же размера,
что и гель, к которой приделаны бортики из липкой бумажной ленты высотой
0,5 см).
- Бумага Whatman Р81.
- Бумага Whatman 3 ММ.
- Груз весом 1 кг.
- Обогревательная лампа или вентилятор с подогревом.
- Полимерная пленка (Saran wrap). Dow Chemical Company Ltd.
- Кассета для экспонирования рентгеновской пленки с усиливающим
экраном.
- Рентгеновская пленка (например, Hyperfilm-MP фирмы Amersham).
Растворы
- Буфер для экстракции NPT-II [NEB] (10%-ный глицерин;
40,0 мМ ЭДТА; 150 мМ NaCl; 100,0 мМ NH4C1; 10,0 мМ трис-НС1, pH 7,5;
3,0 мг/мл ДТТ; 0,2 мг/мл лейпептина;
0,2 мг/мл ингибитора трипсина). На 100 мл:
Глицерин (BDH Analar) 10,0 мл
0,5 М ЭДТА, pH 7,5 8,0 мл
5.0 м NaCl 3,0 мл
NH4C1 535,0 мг
2.0 М трис-НС1, pH 7,5 0,5 мл
ДТТ (BDH) 300,0 мг
Лейпептин (Sigma) 20,0 мг
Ингибитор трипсина (Sigma) 20,0 мг
- Фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), 40 мМ; 7,0 мг/мл в изопропаноле.
Хранят при -20 °С. Примечание: Внимание! ФМСФ очень ядовит.
- Раствор БСА (10 мг/мл).
- Бромфеноловый синий (0,01%-ный в 25%-ном глицерине).
- Буфер для реакции NPT-II [NRB] (67,0 мм трис-малат, pH 7,1; 42,0 мМ
MgCl2, 400,0 мМ NH4C1).
На 1 литр:
Трис-ОН 8,0 г
MgCl2.6H20 8,5 г
NH4C1 21,4 г
354
Глава 6
Растворяют в 500 мл дистиллированной Н20. Доводят pH до
7,1 твердой малоновой кислотой (СН(СООН) : СН.СООН). Для этого
требуется 3-4 г/л. Доводят до 1 л дистиллированной НгО.
,- (у-32Р) АТР, 3000 Ки/ммоль (Amersham).
- Раствор канамицин сульфата (Sigma) (25 мг/мл).
<- 2%-ная агароза с низкой температурой плавления (например, Miles
Scientific: SeaPlaque LGT).
- Раствор протеиназы: трипсин (Sigma), 1 мг/мл в 1%-ном ДСН.
.- Фосфатный буфер (10 мМ Na2P04,' pH 7,6). На 1 литр: Исходный раствор
А: 0,2 М NaH2P04-2H20 (31,2 г/л). Исходный раствор В: 0,2 М Na2HP04-
12Н20 (71,7 г/л). Смешивают 13 мл раствора А с 87 мл раствора В и доводят
до 1 л дистиллированной Н20.
6.7.3.3. Методика
Примечание: все процедуры проводят либо на льду, либо в
холодной комнате при 4 °С.
1. Экстрагируют каждый образеца> (контроль и трансформированную ткань
либо хлоропласты) в NEB (20 мкл на 100 мг ткани), растирая их в пробирке
Эппендорф пластмассовыми палочками. Начав гомогенизацию, затем добавляют
5 мкл БСА и 2 мкл ФМСФ и продолжают гомогенизацию.
2. Центрифугируют, осаждая клеточный дебрис (3 мин в настольной
центрифуге) и переносят супернатант в новую пробирку Эппендорф. Отбирают
аликвоту и определяют содержание белка по Брэдфорду (приложение 6 [III]).
При этом следует учитывать добавленное количество БСА.
3. Разбавляюта> при необходимости образцы 0.1XNEB. Добавляют 1 мкл
раствора бромфенолового синего, перемешивают и наносят образцы целиком в
отдельные лунки охлажденного (4°С) 10%-ного неденатурирующего геля.
Электрофорез проводят в холодной комнате, как описано а разд. 6.7.2.
4. Отделяют (следует помнить: отрубать, а не резать) концентрирующий
гель и вырезают нижнюю часть разделяющего геля точно по размеру пластинки
для анализа (см. стадию 6).
5. Помещают гель в пластмассовую коробку, дважды промывают его
дистиллированной водой и уравновешивают против 100 мл NRB6> в течение 10-
15 мин.
6. Переносят гель на пластинку для анализа, заливают все щели по краям
Предыдущая << 1 .. 151 152 153 154 155 156 < 157 > 158 159 160 161 162 163 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed