Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
кварцевым песком либо стеклянными шариками. Фирма Kontes поставляет
одноразовые пестики, которые подходят к пробиркам Эппендорф, что
облегчает растирание небольших образцов ткани. Способ лизиса зависит от
природы и количества растительной ткани. GUS весьма устойчива к действию
протеиназ, обладает длительным периодом полужизни в живых клетках и
большинстве экстрактов. Тем не менее если протеиназы понижают активность
фермента, то в буфер для лизиса может быть добавлен ФМСФ
(фенилметилсульфонилфторид - эффективный.
Анализ организации и экспрессии генов растений
367
ингибитор сериновых протеиназ) в концентрации 25 мкг/мл, который не
оказывает нежелательного воздействия на GUS.
Экстракты можно длительное время хранить при -70°Сбез какой-либо
потери активности, а также при 4 °С с очень незначительным снижением
активности (по крайней мере в экстрактах из листьев табака, что,
разумеется, зависит от содержания протеиназы). Следует избегать хранения
при -20°С, поскольку при этом, по-видимому, происходит инактивация или
распад фермента, по крайней мере в том буфере для лизиса, состав которого
приведен выше.
Некоторые ткани или клетки содержат большие количества эндогенных
флуоресцирующих веществ или полифенолов. Такие примеси можно удалить,
экстрагируя GUS буфером, в который добавлен Polyclar (нерастворимый
поливинилпироллидон), с последующим пропусканием через колонку с
сефадексом G-25. Поврежденные растительные протопласты, корни и другие
клетки и ткани, обработанные ПЭГ или подвергнутые электропорации, могут
накапливать флуорогенные соединения, которые, вероятно, представляют
собой промежуточные продукты биосинтеза лигнина и других
фенилпропаноидов. Эти вещества in vivo не флуоресцируют, но активируются
при лизисе клетки, если при этом высвобождаются ферменты, способные
расщеплять конъюгаты флуорохромов с гликозидами и другими компонентами, а
проблема может быть устранена при центрифугировании экстрактов через
микроколонки; можно проконтролировать и кинетику накопления флуорохрома,
которая при наличии эндогенных флуорохромов не будет зависеть от
субстрата и, следовательно, не связана с GUS.
6.9.4.1. Определение GUS в протопластах растений
Некоторые смеси ферментов, особенно Rhozyme, используемые для
приготовления протопластов, содержат очень высокие концентрации ^-
глюкуронидазы. Обычное промывание солевым раствором и флотация в сахарозе
позволяют инактивировать GUS в протопластах табака, но в случае других
клеток это может вызвать значительные трудности.
6 9.4.2. Определение GUS в тканях растений, трансформированных
агробактериямя
Клетки агробактерий, содержащие некоторые плазмиды с геном GUS,
обладают значительной глюкуронидазной активностью. Это, очевидно, вызвано
сквозной транскрипцией с гена lacZ плазмиды рВш19 в сторону области,
кодирующей GLJS, с последующей инициацией трансляции с инициаторного
кодона QUS. Агробактерии, не несущие таких плазмид, обладают весь-
368
Глава 6
ма низкой активностью, либо вообще лишены ее. Если кассету, содержащую
ген GUS, инвертировать относительно промотора lac, то фоновая активность
падает более чем в 20 раз (Jefferson and Green, неопубликованные данные).
Следовательно, необходимо тщательно следить за тем, чтобы использовалась
лишь стерильная ткань, либо ставить соответствующие контроли.
6.9.5. Флуориметрическое определение активности GUS
6.9.5.1. Общие положения
Данный метод определения весьма прост и универсален Флуоресцентные
методы в 100-1000 раз чувствительнее колориметрических (общие принципы
метода описаны в литературе; см., например, [19]). Известны два основных
способа флуори-метрического определения GUS: 1) определение общего выхода
продукта в определенный момент времени и 2) измерение кинетики активности
GUS. В описанном ниже эксперименте рассматривается регулируемая светом
экспрессия гена МС-gus по сравнению с конститутивно экспрессируемым геном
35S-СаМV-gus в трансгенных растениях табака. Цель эксперимента-выявление
регулируемой фитохромом экспрессии GUS и количественное определение GUS в
зависимости от содержания ДНК (числа клеток).
6.9.5.2. Материалы
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Флуориметр (например, Perkin Elmer с цифровой индикацией) .
- Кварцевые кюветы (либо пластмассовые кюветы с нужными оптическими
свойствами) к флуориметру.
- Длинноволновая УФ-лампа или УФ-осветитель.
Растворы
- 200 мМ NaP04, pH 7,0. Готовят, смешивая два исходных рас-твора.
Исходный раствор А: 0,2 М ЫаНгРО^НгО (31,2 г/л). Исходный раствор В: 0,2
М Na2HP04 (28,39 г/л). Для получения pH 7,0 смешивают 39 мл А с 61 мл В.
- Буфер для экстракции GUS (50 мМ NaP04, pH 7,0; 10 мМ ЭДТА; 0,1%-ный
тритон Х-100; 0,1%-ный саркозил; 10 мМ р-МЭ). На 100 мл:
200 мМ NaP04, pH 7,0
0,5 М ЭДТА, pH 7,0 Тритон Х-100 (Sigma)
25,0 мл 2,0 мл 0,1 мл
¦Анализ организации и экспрессии генов растений
