Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
[54], или обнаружение небольших иммунореактив-иых пептидов методом
вестерн-блоттинга [37].
Использование вестерн-блоттинга для анализа продуктов гена позволяет
относительно просто получать количественные данные. Например,
установлено, что имеется прямая зависимость между уровнем экспрессии NPT-
II и числом копий соответствующего гена в трансформированных клетках
моркови.
Вестерн-блоттинг способствовал выявлению и видоспецифических различий
в постоянных уровнях NPT-II в трансформированной ткани. Например, после
неоднократных попыток не удалось иммунологически определить NPT-II
методом вестерн-блоттинга в ткани листьев табака, трансформированного
С58С1 (pGV3850: : 1103), даже в том случае, когда фермент выявлялся
биохимическим методом [46]. В настоящее время причины таких различий
неизвестны, однако они могут иметь важные последствия при изучении
экспрессии генов в растениях и влиять на выбор модельных растительных
систем.
16.8.1.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Качающаяся платформа либо медленная круговая качалка.
- Маленькая пластмассовая коробка.
- 10%-ный неденатурирующий полиакриламидный гель (разд. 6.7.2).
- Нитроцеллюлозный фильтр (Schleicher and Schuell, BA-85).
- Прибор для полусухого блоттинга (LKB).
360
Глава 6
Растворы
~ Буфер для экстракции (10% глицерина; 40,0 мМ ЭДТА;
10,0 мМ трис-НС1, pH 7,5; 3,0 мг/мл ДТТ; 0,2 мг/мл лейпеп-тина; 0,2
мг/мл ингибитора трипсина). На 100 мл:
- 40,0 мМ ФСМФ: 7,0 мг/мл в изопропаноле. Хранят при
-20 °С. Внимание! ФСМФ очень ядовит.
- Раствор БСА (10 мг/мл).
- Бромфеноловый синий (0,1% в 25%jhom глицерине).
- Буфер для переноса (TGM). На 1 литр:
- Раствор для блокирования [100,0 мМ трис-НС1, pH 9,0;
150.0 мМ NaCI; 4%-ный раствор обезжиренного сухого молока (Marvel
фирма Cadbury), 0,05% твин 20]. На 1 литр:
2.0 М трис-НС1, pH 9,0 50,0 мл
- Раствор для разведения антител: аналогичен раствору для блокирования,
но содержит 1 % сухого молока.
- Забуференный трисом NaCI (TBS) (50,0 мМ трис-НС1,. pH 7,4; 200,0 мМ
NaCI). На 1 литр:
2.0 М трис-НС1, pH 7,4 25,0 мл
5.0 М NaCI 40,0 мл.
- Раствор для промывания (TBS-твин): TBS+0,1% твин 20_
- Раствор для цветной реакции состоит из трех растворов:
A. 3,0 мг/мл 4-хлорнафтола (Sigma) в метаноле. Готовят перед
использованием. Непродолжительное время можно хранить а темноте при ¦-20
°С.
B. 50 мМ трис-НС1, 200 мМ NaCI. На 100 мл:
5.0 М NaCI 4,0 мл
2.0 трис-НС1, pH 7,6 2,5 мл.
Хранят при комнатной температуре.
C. 6%-ная Н2Ог. На 100 мл:
Глицерин
0,5 М ЭДТА
2,0 М трис-НС1, pH 7,5
ДТТ
Лейпептин (Sigma) Ингибитор трипсина
10.0 мл 8,0 мл 0,5 мл
300,0 мг
20.0 мг
20.0 мг.
Трис-ОН 3,0 г
Глицин 14,4 г
Метанол 200,0 мл.
5,0 м NaCI Сухое молоко Твин 20 (Sigma)
30.0 мл
40.0 г 0,5 мл.
Анализ организации и экспрессии генов растений
361
30%-ная Н20г 20,0 мл
Дистиллированная Н20 80,0 мл.
анят при 4 °С.
Смешивают непосредственно перед использованием: 1,0 мл А,
5,0 мл В, 10,0 мкл С.
Другой способ приготовления: растворяют 20 мг 4-хлорнаф-тола в 2,5 мл
ДМСО, добавляют этот раствор по каплям при постоянном помешивании к 47,5
мл TBS. Добавляют 15 мкл 30% ной Н202. Используют сразу же.
- Антисыворотка кролика к NPT-II в разведении 1 :500.
- Пероксидаза хрена, конъюгированная с IgG к иммуноглобулинам кролика, в
разведении 1 : 1000 (Miles Scientific).
- 7%-ная уксусная кислота.
6.8.1.2. Методика
Метод выделения и электрофореза белков для вестерн-блот-тинга
аналогичен тому, который используют для определения активности NPT-II
(разд. 6.7). Если необходимы количественные результаты, то в каждом
образце следует определить концентрацию белка по Брэдфорду (приложение
61111]) и провести электрофорез, нанеся на каждую дорожку известное
количество белка. В предварительных экспериментах с тотальными белковыми
экстрактами количество белка, наносимого на гель, должно быть
относительно велико - 500-1000 мкг на дорожку. Методика, приведенная
здесь, начинается с того, что берут промытый полиакриламидный гель,
содержащий разделенные белки.
1. Уравновешивают гель буфером TGM в течение 30 мин при 4 °С.
2. Надев новую пару резиновых перчаток, собирают прибор для полусухого
блоттинга (рис. 6.16), следя за тем, чтобы
|___________________ ¦___________I Анод
- - ¦ - Фильтровальна^ бумага
гул1.1.1.¦1Волокнистая прослойка - - - - - - ¦¦
¦ - - Фильтровальная бумага
-----------¦ ---------------Нитроцеллюлозный фильтр
Г:.. ............ I Гепь
. - - ¦ -- ¦ - - Фильтровальная бумага
