Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 164

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 158 159 160 161 162 163 < 164 > 165 166 167 168 169 170 .. 184 >> Следующая

369
Саркозил (Sigma) 0,1 г
р-МЭ (Sigma) 69,75 мкл.
- 1 мМ 4-метилумбеллиферон (4-MU, Sigma, М-1508). Растворяют 19,82 мг
динатриевой соли в 100 мл дистиллированной Н20 и хранят в темноте при 4
°С.
- Буфер для флуориметрического определения GUS. Представляет собой
основной буфер для экстракции GUS с добавлением 1 мМ
метилумбеллиферилглюкуронида (MUG, Sigma, М-9130). Растворяют 35,23 мг
MUG в 100 мл буфера для экстракции GUS. Хранят при 4°С максимум 2 нед.
- 0,2 М Ыа2СОз. Растворяют 2,12 г в 100 мл дистиллированной Н20. Раствор
стабилен в течение нескольких недель при комнатной температуре.
6.9.5.3. Методика
Для анализа небольших количеств p-глюкуронидазы следует использовать 1
мМ 4-метилумбеллиферилглюкуронид (MUG), добавленный в буфер для
экстракции (см. выше); конечный объем реакционной смеси 0,2 мл. Реакцию
проводят при 37 °С и останавливают добавлением 1 мл 0,2 М Na2C03. Затем
измеряют флуоресценцию, как подробно описано ниже.
Кроме того, можно определить кинетику реакции и построить кривую,
которая намного точнее отражает активность фермента.
1. Экстрагируют ткани, как описано в разд. 6.9.4.
2. Для каждого образца предварительно инкубируют 500 мкл буфера для
экстракции GUS, содержащего 1 мМ MUG, при 37 :С.
3. Готовят четыре пробирки Эппендорф, помеченные цифрами 0, 5, 10 и 15, в
каждой из которых содержится по 900 мкл
0,2 М Na2C03. Это необходимо для остановки реакции в строго
определенные моменты времени3).
4. Добавляют 10 мкл экстракта ткани в реакционную смесь, перемешивают и
сразу же переносят 100 мкл в пробирку для остановки реакции (t = 0).
Таким образом, при определении наклона калибровочной кривой будет учтена
собственная флуоресценция экстракта6).
5. Через одинаковые промежутки времени (т. е. через 5, 10 и 15 мин)
отбирают аликвоты объемом 100 мкл в пробирки для остановки реакции.
6. Когда реакция закончится, просматривают пробирки с помощью
длинноволнового УФ-осветителя. 4-MU должен давать голубую
флуоресценцию(r)).
7. 4-MU имеет оптимумы возбуждения при 365 нм и излучения при 455 нм.
Флуориметр следует откалибровать по свеже-
370
Глава Ь
приготовленным стандартным растворам 4-метилумбеллифе-ронаг) в буфере
для экстракции GUS с добавлением 0,2 М Na2C03 в соотношении 1:9. Нулевая
точка на флуориметре должна быть установлена относительно пробы
реакционной смеси, остановленной в нулевое времяЧ Показания прибора
совершенно линейны от предела чувствительности прибора (обычно 1 нм или
менее) до 5-10 мкМ 4-метилумбеллиферо-нае>. Измерения больших количеств
при стандартном оптическом пути 1 см могут быть занижены вследствие
внутренних эффектов и других факторов.
4-метилумбеллиферон. нм
Рис. 6.18. Калибровочная кривая для определения активности GUS с
использованием флуоресцирующего субстрата 4-MU.
8. Для иллюстрации чувствительности флуоресцентного анализа на рис. 6.18
приведен пример калибровочной кривой.
Примечания
*> Добавление Na2C03 преследует две цели: останавливает реакцию и до
предела повышает флуоресценцию продукта, 4-MU. 4-MU содержит единственный
фенольный гидроксил, который для того, чтобы молекула флуоресцировала,
должен быть ионизирован. Значение рКа этого гидроксила слегка щелочное,
и, следовательно, для достижения максимальной флуоресценции раствор
должен быть щелочным.
6> Фоновая флуоресценция в экстракте часто связана с присутствием
следовых количеств гидролизованного субстрата (т. е. метилумбеллиферона)
в коммерческих препаратах. Для сверхчувствительных измерений можно
очистить субстрат, однако на самом деле для большинства исследований это
не требуется. Чтобы свести к минимуму уровень фоновой флуоресценции (4-MU
в MUG), твердый MUG следует хранить в замороженном и сухом состоянии.
Нельзя открывать еще холодный флакон (конденсация воды из воздуха будет
способствовать гидролизу содержимого). Раствор. MUG в буфере для лизиса
остается пригодным при хранении в герметнч-
Анализ организации и экспрессии генов растений
371
ной посуде в течение нескольких недель, но затем начинает все сильнее
флуоресцировать.
в> Можно провести очень простой и чувствительный качественный анализ,
поместив пробирку на длинноволновый ультрафиолетовый осветитель н
наблюдая голубую флуоресценцию. При этом можно проводить определения в
очень небольших объемах (50 мкл или менее), реакцию останавливают
добавлением 25 мкл 1 М Na2C03, используя планшет для микротитрования или
пробирки Эппендорф. г> Готовят стандартные растворы 4-метилумбеллиферона
в 0,2 М Na2C03 с концентрацией до 100 нм из исходного 1 мМ раствора
натриевой соли
4-MU в воде. 4-MU не обладает особенной фотолабильностью, но, по-
видимому, следует оберегать его от сильного света и хранить исходный
раствор в посуде с притертой пробкой. в> Если собственная флуоресценция
экстракта вызывает серьезные затруднения, ограничивающие чувствительность
определения, можно либо до начала анализа экстрагировать флуоресцирующий
Предыдущая << 1 .. 158 159 160 161 162 163 < 164 > 165 166 167 168 169 170 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed