Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
вторичные графики зависимости наклонов можно использовать для расчета
ингибиторной константы, входящей в уравнение (8.69) совместно с KsA, а
вторичные графики для длин отрезков - для расчета соответствующей
константы, входящей в это уравнение совместно с КАм.
НАЛИЧИЕ ИНГИБИТОРА В ПРЕПАРАТЕ СУБСТРАТА
При наличии ингибитора в препарате субстрата увеличение концентрации
субстрата в исследуемой системе сопровождается параллельным увеличением
концентрации ингибитора. Нередко при определении активности
стереоспецифического фермента используют DL-субстрат. Если "неактивный"
изомер является ингибитором фермента, то не достаточно просто рассчитать
концентрацию "активного" изомера субстрата. В работе [2072] этот простой
случай рассмотрен на примере химотрипсина. В случае DL-субстрата,
содержащего равные количества субстрата и ингибитора (i=s), вместо
стандартного уравнения для конкурентного ингибирования (8.6) можно
воспользоваться уравнением
A=-feL+(l+4f)4. (8.71)
Таким образом, наклон графика двойных обратных величин не изменяется при
наличии в системе конкурентного ингибитора, а кажущиеся V и Км
уменьшаются в (l + Kyi/Ki) раз.
Более общий случай, когда концентрация конкурентного ингибитора не равна
концентрации субстрата, проанализирован в в работах [958, 960, 4815].
Если выразить концентрацию инги-
Ингибирование и активация ферментов
511
битора в препарате субстрата через i=xs и подставить это выражение в
(4.6), то в обратной форме это уравнение будет иметь вид
Следовательно, как и в рассмотренном выше простом случае, при наличии в
препарате субстрата конкурентного ингибитора график двойных обратных
величин будет представлять собой прямую, параллельную прямой, которая
получена в отсутствие ингибитора; при этом кажущиеся V и Км уменьшатся в
(I + xKmIKi) раз. Степень наблюдаемого ингибирования будет зависеть от
отношения KmIKi', при Кг-САм ингибирование будет существенным даже при
очень небольшом содержании ингибитора в препарате субстрата. Дальциль
показал, что в некоторых препаратах NAD имеются примеси, действующие как
конкурентные ингибиторы, и вывел уравнение для случая двухсубстратных
ферментов, используя в качестве основы уравнение (8.69) н полагая, что
конкурентный ингибитор содержится в препарате субстрата А:
Из уравнения следует, что в этом случае действие ингибитора будет
аналогично таковому для "простого" рассмотренного выше случая при
изменении концентрации субстрата А; если же изменяется концентрация
субстрата В, то будут увеличиваться и наклон графика двойных обратных
величин, и длина отсекаемого им отрезка.
Когда ингибитор, присутствующий в препарате субстрата, является
неконкурентным, подстановка xs = i в уравнение (8.23)
Очевидно, что уравнению (8.75) соответствует нелинейный график двойных
обратных величин; такой график приведен на рис. 8.7. Этот график можно
сопоставить с тем, который получают в случае ингибирования высокими
концентрациями субстрата (гл. 4). Экстраполяция линейного участка кривой
при S'->-0 (когда величиной xsjKi можно пренебречь) дает точку
(8.72)
дает [958]
V
(8.74)
или в обратной форме
V
Ks J_ V s
(8.75)
512
Глава 8
А Конкурентное Б Неконкурентное или В Бесконкурентное
смешанное
Рис. 8.7. Графики, иллюстрирующие влияние примеси ингибитора в препарате
субстрата. На графиках двойных обратных величин сплошная кривая
соответствует результатам, полученным с чистым субстратом, а пунктирная -
с субстратом, содержащим ингибитор. Линейный участок кривой
экстраполирован до пересечения с осью абсцисс, от которой он отсекает
отрезок -(Ks+Ki/x) в случае конкурентного ингибирования и -Kt'O/x+Ks/Kt)
в случае смешанного ингибирования.
пересечения с осью 1/у с ординатой 1/У (1 + xKs/Ki)\ при этом наклон
оказывается таким же, как и в отсутствие ингибитора (т. е. кажущаяся Ks
уменьшается в 1 + xKs/Ki раз).
Строя график зависимости 1/у от s для данных при высоких концентрациях
субстрата (когда можно пренебречь членом Ksfs), получим, что длина
отрезка, отсекаемого соответствующим графиком от оси 1/у, равна 1/У(1
+xKslKi), а наклон - xjVKr, следовательно, длина отрезка, отсекаемого от
оси s, будет равна Ks+Ki/x.
Подставляя xs - i в уравнение (8.32) в случае смешанного ингибирования,
находим
V
у =
К
1 +
или в обратной форме [804]
xKs
Ki
xs
w
ks
/ KSX
\ 1
(8.76)
Ингибирование и активация ферментов
513
Это уравнение аналогично (8.75) и, следовательно, должно наблюдаться
кажущееся ингибирование при высоких концентрациях субстрата. В случае
двухсубстратных ферментативных реакций смешанное ингибирование в
отношении одного из субстратов наиболее часто обусловлено действием
ингибитора, который оказывается конкурентным по отношению к другому
субстрату. Так, в системе, представленной уравнением (8.69), ингибитор,
являющийся конкурентным по отношению к субстрату А, будет смешанным по
отношению к субстрату В. Уравнение двойных обратцых величин можно
получить для данного случая из
