Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
(8.73).
Если в препарате субстрата присутствует бесконкурентный ингибитор,
подстановка xs = i в уравнение (8.46) дает
НТГ <8'76 б>
1 + Ki +
или в обратной форме [804]
1 _ Км
Vs
Следовательно, в данном случае графики двойных обратных величин будут
сходны с теми, которые наблюдаются для неконкурентного ингибирования;
кажущиеся V и Км, получаемые при экстраполяции в область малых s (когда
величиной xs/Ki можно пренебречь), не изменяются, а график зависимости
I/о от s при высоких концентрациях субстрата (когда можно пренебречь
величиной /(м/s) отсекает от оси s отрезок длиной -Ki/x. Уравнение (8.73)
совпадает по виду с уравнением (4.219), характеризующим ингибирование
высокими концентрациями самого субстрата.
Производя соответствующую подстановку в уравнение (4.86), получаем для
двухсубстратной реакции следующее уравнение:
ts А ь'В fc'Ab'B дм , Ам , ASAM , I 1 , ха
ab 1 V1 Ki
у-• (8.76 г)
Следовательно, присутствие ингибитора, бесконкурентного по отношению к
одному из субстратов, не повлияет на графики двойных обратных величин при
низких концентрациях этого субстрата (ха//(<-С 1), но приведет к
кажущемуся ингибированию высокими концентрациями субстрата.
Поскольку при наличии в препарате субстрата неконкурентного, смешанного
или бесконкурентного ингибитора могут наблюдаться эффекты, кинетически
неотличимые от простого ингибирования высокими концентрациями субстрата,
в тех случаях, когда такого типа ингибирование наблюдается, следует
принимать специальные меры с целью тщательной очистки
514
Глава 8
субстратов. Хоуслей и Типтон [2061] показали, что наблюдаемое при
окислении бензиламина аминоксидазой (КФ 1.4.3.4) ингибирование высокими
концентрациями субстрата обусловлено наличием в последнем примеси
продукта - бензальдегида; авторы приводят уравнения ингибирования
(обусловленного примесями в субстратах) двухсубстратных ферментов,
функционирующих по механизму двухстадийного переноса. Клеланд и др. [804]
рассмотрели вопрос о действии примесей, вызывающих частичное
ингибирование в односубстратных реакциях.
ДРУГИЕ ТИПЫ ИНГИБИРОВАНИЯ
Все типы ингибирования, которые Мы обсуждали до сих пор, предусматривают
прямое соединение ингибитора с ферментом; однако ингибирование будет
вызываться также веществами, которые соединяются с субстратом,
коферментом или активатором, блокируя их, т. е. делая недоступными для
фермента. Такое ингибирование оказывается возможным лишь в том случае,
если концентрация блокирующего вещества есть величина того же порядка,
что и концентрация блокируемого субстрата или кофактора; добавление
большого количества субстрата или кофактора снимает это ингибирование.
Рассмотрим схему реакции
E + S=s=fcES >Е + Р, (8.77)
SI
в которой комплекс SI не может взаимодействовать с ферментом. В этом
случае концентрацию свободного субстрата (Sf) можно выразить через полную
концентрацию субстрата (s) и концентрацию комплекса SI (г):
sf=s-z, (8.78)
и, поскольку
г=-g-. (8.79)
концентрация свободного субстрата определится выражением
*=7г+кг (8-80)
Если подставить это выражение в обычное уравнение Михаэлиса, то получим
v=iы- -------------• <8-81>
-Г-(1+ */*")+!
Ингибирование и активация ферментов
515
Это выражение идентично уравнению для простого конкурентного
ингибирования (8.6) и, следовательно, рассматриваемый тип ингибирования
неотличим от него при обычных кинетических исследованиях. Целесообразно
поэтому предварительно проверить, не происходит ли взаимодействие
ингибитора с субстратом, прежде чем делать заключение о том, что
наблюдаемое конкурентное ингибирование обусловлено конкуренцией
ингибитора за участок связывания на ферменте. Одним из случаев, когда
конкурентное ингибирование вызвано соединением ингибитора не с ферментом,
а с субстратом, является ингибирование РНК-полимеразы этидиумбромидом;
последний соединяется с субстратом - ДНК [2420].
НЕЛИНЕЙНАЯ КИНЕТИКА ИНГИБИРОВАНИЯ
Мы уже говорили о том, что, как правило, при частичном ингибировании
графики зависимости обратной скорости от обратной концентрации являются
линейными, однако вторичные графики зависимости наклонов или длин
отрезков (в зависимости от механизма ингибирования) от i отклоняются от
линейности вниз; такого же типа графики наблюдаются и для зависимости l/v
от г. Кроме того, известны случаи ингибирования, когда соответствующие
кривые отклоняются от линейности вверх по параболическому закону. Эти
типы ингибирования наблюдаются в тех случаях, когда к одной и той же
форме (интермедиату) фермента может присоединяться не одна молекула
ингибитора, а две или больше. Хотя для односубстратных ферментов подобная
ситуация маловероятна, в более сложных ферментных системах она вполне
возможна. Тем не менее целесообразно рассмотреть этот вопрос на примере
односубстратной системы. Три возможные, однако маловероятные, системы, в
которых две молекулы ингибитора связываются с одной и той же формой
фермента, приведены вместе с соответствующими уравнениями в табл. 8.3.
