Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
Из этого уравнения видно, что при указанных выше условиях может иметь
место бесконкурентное ингибирование.
В случае односубстратных реакций бесконкурентное ингибирование
наблюдается крайне редко, оно было описано при действии L-фенилаланина на
щелочную фосфатазу (КФ 3.1.3.1) из кишечника крысы [1536]. Напомним, что
гидролитические ферменты обычно считаются односубстратными, поскольку
полагают, что концентрация второго субстрата, воды, достаточна для
полного насыщения фермента.
Тип IV6: частичное бесконкурентное ингибирование. Этот [учай может быть
представлен схемой
к к
Е+s ? ES -+2 Е+продукты
(8.49)
1 к + 3
EIS -¦ Е+1 + Продукты
496
Глава 8
Здесь, как и раньше k+2<k+2. Поскольку в данном случае по определению
ингибитор не связывается со свободным ферментом, то предполагается, что
он освобождается из комплекса EIS одновременно с продуктом. Такой
механизм не был обнаружен ни для одного односубстратного фермента, однако
на его основе можно объяснить более сложные ферментативные реакции.
В условиях равновесного связывания субстрата и ингибитора уравнение
скорости имеет вид
к+$Р_____________|______к+з<>__________
1 +
Ks
Ki
¦+-5Ч'+4-)
ks
(к+з/к+г)1
Ks
• +
(1 -f- i/Kt)
(8.50)
1 +
(^+3/^+2) ^
Ki
Уравнение, обратное данному, запишется в виде
Ks
I
1
(k+3/k+2) i k+# ' s
+ 1
(1 + UKi)
Ki
1 +
(^+3/^+2) i Ki
k+2e
(8.51)
Следовательно, графики двойных обратных величин при фиксированных
концентрациях I будут представлять собой прямые, наклон которых
уменьшается при увеличении ц прямые пересекаются в точке, лежащей выше
оси +1 /s, абсцисса которой равна (1- k+3/k+2) I (К$+з/к+2), а ордината-
1/&+3е (рис. 8.1). Таким образом, при низких концентрациях субстрата
(справа от точки пересечения) I выступает в роли активатора, а при более
высоких концентрациях субстрата - в роли ингибитора. При
Рис. 8.1. График двойных обратных величин для системы с частичным
бесконкурентным ингибированием.
Ингибирование и активация ферментов
497
очень высоких концентрациях ингибитора график двойных обратных величин
приближается к прямой, параллельной оси 1/s, и, следовательно, скорость
реакции стремится к некой конечной величине. При k+z=k+2 I действует как
активатор, снижающий Ks и не влияющий на V; в этом случае прямые
пересекаются в точке, лежащей на оси I/o.
Для механизма (8.49) в стационарном приближении кинетическое уравнение в
обратной форме имеет вид
1 1 + Wi' 7~+ Г 1 + t/Ki 1 VT1
V $ ! . *±з_ _i- *+2 *1 . l+^-i/Ki к+2 k+yB
где Ki= ¦ k'~~t k+3 , K'i- k+1^ \+ • Из этого уравнения сле-
"+4 "+4*+з
дует, что зависимость I/о от 1/s должна быть линейной; такой же, согласно
уравнению (8.51), должна быть и зависимость I/о от i.
СВОДКА, ИЛЛЮСТРИРУЮЩАЯ РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ влияния ИНГИБИТОРОВ
Влияние ингибиторов различных типов при пяти разных способах графического
изображения уравнения Михаэлиса представлено на рис. 8.2. В каждом случае
стрелка показывает направление, в котором график смещается в присутствии
ингибитора. Типы а представлены теми же графиками, что и типы б, потому
что направление смещения в обоих случаях одинаково, хотя для типов б с
увеличением концентрации ингибитора это смещение достигает определенного
предела, а для типов а нет.
Пять рядов графиков, приведенных на рис. 8.2, соответствуют пяти методам
графического изображения уравнения Михаэлиса, представленным на рис.
4.12. Метод построения по Лай-нуиверу - Бэрку (третий ряд сверху)
применяется особенно широко для определения типов ингибирования. При
чисто конкурентном ингибировании прямые пересекаются в точке, лежащей на
оси ординат, а при чисто неконкурентном - на оси абсцисс. В случае
ингибирования смешанного типа точка пересечения прямых лежит ниже или
выше оси абсцисс, при бесконкурентном ингибировании прямые параллельны.
Графический анализ не всегда позволяет легко отличить один тип
ингибирования от другого. Так, в случае смешанного ингибирования точка
пересечения может лежать очень близко к одной из осей, и бывает трудно
исключить конкурентное или неконкурентное ингибирование. При
бесконкурентном же ингибировании нужна достаточно высокая точность, чтобы
показать, что прямые действительно параллельны, а не образуют некоторый
угол. Поскольку данные по ингибированию часто использу-
Бесконкурентное
рКшрКр -Igs
1
V
1 /у
V
% *р
1
V
1
i
V
1 1 1
Рис. 8.2. Влияние ингибиторов различных типов на пять форм графиков,
описывающих зависимость между концентрацией субстрата и скоростью
ферментативной реакции. Кр и VP - это величины /См и Vi наблюдаемые в
присутствии ингибитора.
500
Глава 8
ют для выбора кинетического механизма, по которому функционирует фермент
(гл. 4), важно однозначно определить тип ингибирования, а для этого
необходимо провести измерения в широком диапазоне концентраций
ингибитора.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНГИБИТОРНЫХ КОНСТАНТ
1. Величины Ki можно определить методом Лайнуивера - Бэрка, зная длины
